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蛐蛐兒兒新蟲 (初入文壇)
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蛋白測(cè)不到活性，求解答 已有2人參與
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本人用鎳柱純化蛋白后，跑SDS發(fā)現(xiàn)咪唑濃度為20mM時(shí)條帶最亮最寬，收集20mM咪唑的洗脫液之后，超濾濃縮（除咪唑了）之后發(fā)現(xiàn)測(cè)不到酶活。 細(xì)胞發(fā)酵液，細(xì)胞發(fā)酵液破碎后的液體，收集細(xì)胞重懸并破碎的液體，破碎液離心取的上清，以及經(jīng)過鎳柱第一次收集的液體均可以測(cè)到酶活且都較高. 0mM的咪唑也可以測(cè)到活性但相對(duì)較低，5.10.20...mM(除去咪唑和不除去均測(cè)不到)的洗脫液均測(cè)不到活性 未加IPTG誘導(dǎo)的工程菌測(cè)不到酶活 有大神可以為我解釋一下嗎？本人研二，這個(gè)問題解決不了怕真的要延期了 T.T |
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20mM洗脫比較奇怪，一般這個(gè)濃度洗雜。100-300mM洗脫。我們用purimag的Ni磁珠是這樣的。 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
2樓2018-07-03 21:25:41
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3樓2018-07-04 10:03:37
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5mM咪唑就能洗下來？你確定配置沒問題？平衡液里面咪唑濃度都這個(gè)值了 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
4樓2018-07-04 10:22:55
【答案】應(yīng)助回帖
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可能性有二個(gè)： 一是純化的過程中你的蛋白失活了，所以導(dǎo)致有蛋白條帶但無酶活； 二是你用20mM的咪唑洗脫得到的酶液里面可能沒有你的目的蛋白，有可能是與之大小一致的雜蛋白，如果是這樣的話，你的 目的蛋白并沒有被洗脫下來； 問下你純化過程中濾出液有沒有 酶活呢？另外你用100-300mM的咪唑洗脫之后的酶液是否有酶活呢？不能僅僅看蛋白多少來判定的，另外我看你都是通過SDS-PAGE檢測(cè) ，并沒有做WB，建議你可以做個(gè) WB看一下你的目標(biāo)蛋白含量情況呢 |
5樓2018-07-04 10:24:32
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6樓2018-07-04 10:53:50
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7樓2018-07-04 10:57:13
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9樓2018-08-30 19:58:57
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