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白細(xì)胞介素8蛋白表達(dá)純化及其與腫瘤的關(guān)系 已有2人參與
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白細(xì)胞介素是一類分子結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能已基本明確，并具備調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞因子。按照其發(fā)現(xiàn)順序給予序號(hào)，目前已經(jīng)命名38種（IL-1～I(xiàn)L-38）。IL-8屬于其中一組小的分泌型炎癥性細(xì)胞因子，IL-8蛋白表達(dá)純化可為其進(jìn)一步的理論研究和大批量生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。研究發(fā)現(xiàn)IL-8 不僅可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移，更是預(yù)示癌癥患者不良預(yù)后的細(xì)胞因子，靶向 IL-8 信號(hào)通路的藥物有望成為防治腫瘤轉(zhuǎn)移的抗癌新藥。 1、白細(xì)胞介素8蛋白表達(dá)純化與活性檢測(cè) 白細(xì)胞介素—8 (Interleukin-8, IL-8)是一種多功能性的細(xì)胞因子，屬于趨化因子CXC亞家族的一員，是體內(nèi)炎癥反應(yīng)應(yīng)答的主要介質(zhì)之一。除常規(guī)生化檢測(cè)方法之外，可利用基因工程技術(shù)實(shí)現(xiàn)重組人源性IL-8蛋白表達(dá)純化，并利用PCA技術(shù)實(shí)現(xiàn)重組IL-8活性檢測(cè)。美迪西生物醫(yī)藥是一家醫(yī)藥研發(fā)外包公司，在重組蛋白表達(dá)與純化服務(wù)方面經(jīng)驗(yàn)豐富，其擁有多種蛋白表達(dá)系統(tǒng)，包括原核蛋白表達(dá)系統(tǒng)、酵母蛋白表達(dá)系統(tǒng)、昆蟲(chóng)細(xì)胞蛋白表達(dá)系統(tǒng)（桿狀病毒）哺乳動(dòng)物細(xì)胞蛋白表達(dá)系統(tǒng)。 將3種不同亞型的重組人IL-8基因片段分別與表達(dá)載體pME-15-6His和pET-32a連接，轉(zhuǎn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞HEK 293F和大腸桿菌BL2l(DE3)，進(jìn)行IL-8的表達(dá)。采用IMAC親和層析柱對(duì)重組人IL-8進(jìn)行純化。根據(jù)PCA技術(shù)，構(gòu)建了Split-TEV GPCR激活檢測(cè)系統(tǒng)，對(duì)純化的目的蛋白進(jìn)行了細(xì)胞內(nèi)生物學(xué)活性檢測(cè)。結(jié)果成功構(gòu)建了真核表達(dá)載體pME-15-6His/IL-8formI，前體IL-8基因在HEK293F中正確分泌表達(dá)，其N端信號(hào)肽(殘基1-20)被切除，經(jīng)過(guò)純化得到的重組蛋白為成熟的IL-8 form I(殘基21-99)；成功構(gòu)建了原核表達(dá)載體pET-32a/IL-8 formII和pET-32a/IL-8 form III，N端融合了Trx標(biāo)簽的重組蛋白在大腸桿菌中正確表達(dá)，經(jīng)過(guò)純化和重組腸激酶酶切得到的重組蛋白為IL-8 form II(殘基23-99)和IL-8form III(殘基28-99)。純化后的重組人IL-8對(duì)其天然受體IL8RB具有明顯的激活活性，其ECso值分別為：12.32ng/ml (Form Ⅰ)、15.14 ng/ml (Form Ⅱ)和2.85ng/ml (Form Ⅲ)。 成功構(gòu)建、表達(dá)和純化了具有生物學(xué)活性的3種不同亞型的重組人IL-8，為進(jìn)一步的理論研究和大批量生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。研究表明IL-8在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)與分化、炎性反應(yīng)、免疫應(yīng)答、機(jī)體防御損傷及修復(fù)等過(guò)程中起著重要作用，也有研究發(fā)現(xiàn)，IL-8在腫瘤發(fā)生發(fā)展中也發(fā)揮重要作用。 2、白細(xì)胞介素8與腫瘤的關(guān)系 （1）白細(xì)胞介素8的表達(dá)與腫瘤的關(guān)系 趨化因子IL-8的表達(dá)可分為組成型和誘導(dǎo)型。研究發(fā)現(xiàn)，IL-8的組成型表達(dá)與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)晚期結(jié)腸癌患者血清IL-8表達(dá)水平較健康對(duì)照高10倍，IL-8高表達(dá)不僅與腫瘤臨床分期相關(guān)聯(lián)，而且與化療初不良反應(yīng)、腸壁浸潤(rùn)及肝臟轉(zhuǎn)移亦相關(guān)聯(lián)。 （2）白細(xì)胞介素8與腫瘤易感性的關(guān)系 易感性指在相同環(huán)境下，由遺傳基礎(chǔ)所主導(dǎo)的不同個(gè)體患病的風(fēng)險(xiǎn)。隨著對(duì)腫瘤研究的不斷深入，易感性的研究在腫瘤中占據(jù)越來(lái)越重要位置，并成為研究的一個(gè)重要課題。作為腫瘤微調(diào)節(jié)器，IL-8不僅表現(xiàn)為腫瘤中表達(dá)水平的變化，而且與腫瘤如胃癌、食管癌、肺癌、口腔癌等易感性相關(guān)聯(lián)。研究結(jié)果表明IL-8-251A/T單核苷酸多態(tài)性與腫瘤的易感性相關(guān)，為深入探究IL-8與腫瘤的關(guān)系做好鋪墊，為腫瘤的治療提供新的途徑。 （3）IL-8與腫瘤血管生長(zhǎng)的關(guān)系 腫瘤生長(zhǎng)的血管依賴性理論指的是腫瘤的發(fā)展演進(jìn)除與其自身細(xì)胞增殖有關(guān)外，更需要其周圍血管提供豐富的營(yíng)養(yǎng)支持。這一里程碑理論的提出為腫瘤的研究開(kāi)拓了一個(gè)新的研究領(lǐng)域，通過(guò)阻斷血管的生成，就有可能抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，進(jìn)而抑制腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。經(jīng)過(guò)幾十年的探索，發(fā)現(xiàn)多種細(xì)胞因子均與血管生成密切相關(guān)，如VEGF家族、表皮生成因子（EGF）、血管生成素家族、FGF家族、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子以及趨化因子家族等，其中趨化因子IL-8是近年來(lái)研究的熱點(diǎn)。研究者發(fā)現(xiàn)IL-8能以自分泌和旁分泌形式上調(diào)IL-8、膠原酶Ⅳ、VEGF、EGFR和下調(diào)E-鈣黏蛋白在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)以及增加MMP-9的活性和侵襲力直接或間接調(diào)控腫瘤血管的生長(zhǎng)。還有研究者發(fā)先IL-8還可通過(guò)抑制內(nèi)皮細(xì)胞的自發(fā)性凋亡而調(diào)節(jié)腫瘤血管的生長(zhǎng)，進(jìn)一步證實(shí)IL-8與腫瘤血管生長(zhǎng)的密切關(guān)系。 （4）IL-8與腫瘤演進(jìn)的關(guān)系 腫瘤演進(jìn)指腫瘤惡性程度逐步增高的過(guò)程，包括生長(zhǎng)速度加快、浸潤(rùn)周圍組織并發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）是癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)，而E-cadherin、β-catenin的變化是EMT的特征性標(biāo)志，研究者應(yīng)用免疫組化的方法，對(duì)肝細(xì)胞肝癌患者石蠟組織切片標(biāo)本中IL-8、β-catenin、E-cadherin、MMP-9等指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，IL-8與β-catenin、MMP-9的表達(dá)呈正相關(guān)，與E-cadherin的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。IL-8高表達(dá)標(biāo)本中β-catenin、 MMP-9的表達(dá)相應(yīng)增加，E-cadherin的表達(dá)則出現(xiàn)降低。 （5）IL-8與腫瘤耐藥性的關(guān)系 隨著化療藥物的廣泛使用，腫瘤的耐藥問(wèn)題日益突出。最近的研究發(fā)現(xiàn)耐藥的多種腫瘤（如肺癌、胃癌、乳腺癌、膀胱癌等）中IL-8的表達(dá)水平均有不同程度升高。研究者以四種上皮性卵巢癌細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，多途徑研究IL-8與卵巢癌細(xì)胞的耐藥性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，卵巢癌細(xì)胞的耐藥性與IL-8對(duì)耐藥相關(guān)基因（MDR1、MRP、LRP、GST-P、Topo-N）以及凋亡相關(guān)基因（Bc-l2、Bc-lxL、Mc-l1、XIAP）的調(diào)控有關(guān)，進(jìn)行深入研究發(fā)現(xiàn)該調(diào)控作用具有劑量依賴性。IL-8表達(dá)水平高的卵巢癌細(xì)胞，耐藥相關(guān)基因以及凋亡相關(guān)基因的表達(dá)也相應(yīng)增高，使化療藥物產(chǎn)生的凋亡信號(hào)成為無(wú)效信號(hào)，細(xì)胞凋亡減少，最終導(dǎo)致卵巢癌細(xì)胞對(duì)順鉑和紫杉醇的敏感性降低。 IL-8在惡性腫瘤中的高表達(dá)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，不僅影響腫瘤血管的生成，而且能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移到周圍淋巴結(jié)以及轉(zhuǎn)移到周圍組織肝和肺等。通過(guò)血清、血漿、細(xì)胞上清液以及組織勻漿中IL-8的檢測(cè)，可能為惡性腫瘤的早期診斷提供幫助。干擾或下調(diào)IL-8的表達(dá)，阻礙其功能的發(fā)揮，進(jìn)而抑制腫瘤發(fā)展演進(jìn)、延緩病程進(jìn)展，以期為惡性腫瘤的靶向治療提供新的思路。 |
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3樓2018-08-25 14:51:37
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