 |
 |
 |
 |
 |
 |
||
 |
 |
 |
 |
 |
小木蟲論壇-學術科研互動平臺 » 生物醫(yī)藥區(qū) » 分子生物 » 綜合其他 » 電轉染實驗影響因素
| 2 | 1/1 | 返回列表 |
| 查看: 694 | 回復: 1 | |||
[交流]
電轉染實驗影響因素 已有1人參與
|
|
1 電場參數 電場是電轉染的重要因素，細胞在電場的作用下，膜通透性增加或是形成小孔，以完成轉染過程。因此電場強度是應該被優(yōu)化的主要參數。電場強度不能過高，過高會增加細胞的死亡率；也不能過低，過低不能增加膜的通透性或在膜上形成小孔。因此，一個適宜的電場強度至關重要。 不同細胞系具有不同的最佳場強值，其確定方法除了實驗直接測定比較不同場強下轉染率的高低外，還可以采取較為簡便的間接法。文獻顯示存活率在50%左右的電場參數為理想參數，故可間接測定存活率來確定最佳場強值。 2脈沖過程 1）脈沖波形 脈沖波形主要分為兩種：1、方波脈沖；2、指數遞減波脈沖。 方波脈沖是指：電壓瞬間升至預設電壓，保持電壓放電，然后瞬間終止放電。 一般哺乳動物細胞電轉染時選擇方波脈沖，有較高的轉染效率和細胞存活率。 指數遞減波脈沖是指：先對電容充電，然后讓電容完全放電，其電壓變化呈指數遞減。一般這種波形的脈沖電轉染適用于細菌、酵母菌、昆蟲細胞。 2）脈沖時間 脈沖時間的選定主要取決與脈沖波形。在方波脈沖中，脈沖時間可直接設定。在指數遞減波脈沖中，脈沖時間是指電壓衰減至初始電壓1/3時所用的時間，等于電容（C）與電阻（R）的乘積，單位是ms。在參數優(yōu)化中，增加電壓應當降低脈沖時間，而減小電壓則應當增大脈沖時間。 3）脈沖次數 一般而言，對于大多數細胞類型都選擇單次脈沖。而在有些情況下可能會用到多次脈沖，因為低電壓、短脈沖時間、多次脈沖可有效避免細胞損傷。多次脈沖建議中間間隔1min。 3細胞因素 用于電轉的細胞一般選取處于對數生長期的細胞（15代以內，傳代后2d）。因為處于對數生長期的細胞分裂旺盛，表面結構致密比穩(wěn)定期的細胞差，電轉后，細胞膜的恢復能力強，而且處于有絲分裂期的細胞更容易接受外源DNA.細胞懸液濃度一般為1*106/ml，當細胞生長密度大于3*106/ml，轉染效率會下降。原因除了細胞老化外，細胞過密會使相鄰細胞相互作用增大，甚至使細胞相互融合，從而導致電場的局部微擾，使電場環(huán)境無法均一化，細胞體積越大對電擊越敏感，所需電場強度也越小。 4 質粒因素 從質粒濃度看，細胞密度為1*106/ml，DNA用量在2-5ug/ml轉染效率最高。轉染率在一定一定范圍內隨質粒濃度的上升呈線性增高，但是到達一個峰值后，隨DNA用量增加而轉染率逐漸下降，其原因可能為細胞吸納DNA有一個飽和度，過量便會產生毒性，使存活率降低，不利于轉染率提高。 進行小分子量的分子轉染時（siRNA/miRNA），應使用高電壓、短脈沖時間。大分子量分子轉染時（DNA），應使用低電壓，長脈沖時間。 從質粒的純度看，用高純度的DNA才 能提高電轉的效率，且應注意以下幾點：首先DNA／RNA應該超純(A260／A280>1．8)，其次應不含內毒 素，同時質粒應溶于雙蒸水而不是TE緩沖溶液。 5 溫度 一般情況下，電轉的過程是在室溫下進行，但在 電擊前后可對細胞進行冰浴處理。電擊前冰浴的時間對轉染率影響不大，但低溫環(huán)境能夠防止DNA被外源性DNA酶降解，并限制在電擊中因Joule作用而產生的不良反應，因此，實驗一般選擇電擊前冰浴5min。電擊后冰浴，會影響DNA攝入，因為電擊后冰浴可增強細胞收縮，細胞膜上的 電穿孔封閉較慢，延長外源性DNA攝入時間，從而提高其攝入量。在室溫環(huán)境下，雖然細胞膜上的孔 封閉速度快，但在隨后2h，質粒還可通過電內化進入細胞，因此攝人量不一定比4℃環(huán)境下低。而且，室溫下細胞在5 min內即閉孔，在4℃的環(huán)境下穿孔狀態(tài)可保持4h，穿孔封閉緩慢降低了存活率，同時細胞在低溫下更容易受到損傷。 因此，綜合考慮攝人量和存活率，大部分文獻傾向于電擊后細胞仍在室溫或37℃下保存。 6電轉染試劑的選擇 電擊會對細胞造成一定程度的傷害，在轉染試劑的選擇上要注意，應選擇具有細胞膜修復成分的電轉染試劑，如Entranster-E，將電擊對細胞的損傷降到最低。 7電轉后培養(yǎng)液的選擇 細胞在電擊后十分脆弱，其 培養(yǎng)液的選擇應注重提高細胞的存活率，一般選擇 低滲的RPMI 1640+10％FCS。除此之外，可參考 加入50 mmol／L海藻糖+1.25％DMSO，因為海藻 糖具有穩(wěn)定DNA、蛋白質以及細胞膜的作用，并提高電轉后細胞特別是淋巴細胞的存活率。此外， 有文獻顯示凋亡是細胞電擊后死亡的主要原因，電 擊后的培養(yǎng)液還可加入Caspase抑制劑和SCFGM-CSF等細胞因子。 |
回復此樓» 猜你喜歡
不合理蛙科研實驗之“蛙測重金屬我背鍋三千”
已經有0人回復
-
不合理蛙科研實驗之“鼠逃三次我發(fā)三篇SCI”
已經有0人回復
-
化學工程及工業(yè)化學論文潤色/翻譯怎么收費?
已經有74人回復
-
納米粒度分析
已經有3人回復
-
林科院林化所招收材料與化工專業(yè)碩士，坐標南京
已經有0人回復
-
留學--博士招生
已經有16人回復
-
化學工程，本211，求調劑，ab區(qū)不限
已經有4人回復
-
湖北師范大學招調劑啦
已經有6人回復
-
邵陽學院食品與化學工程學院碩士調劑
已經有0人回復
» 本主題相關商家推薦: (我也要在這里推廣)
分子-黃雁
新蟲 (初入文壇)
- 應助: 0 (幼兒園)
- 金幣: 150.8
- 帖子: 50
- 在線: 5.1小時
- 蟲號: 7314995
- 注冊: 2017-10-17
- 專業(yè): 生物物理、生物化學與分子
★
小木蟲: 金幣+0.5, 給個紅包，謝謝回帖
小木蟲: 金幣+0.5, 給個紅包，謝謝回帖
|
您好，我現在做的是將5000bp的回補質粒電轉入嗜水氣單胞菌的突變株中，因為是第一次接觸，希望您能給些建議，謝謝 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
2樓2019-05-14 17:10:18
相關版塊跳轉
我要訂閱樓主 書畫江湖 的主題更新
| 2 | 1/1 | 返回列表 |
| 最具人氣熱帖推薦 [查看全部] | 作者 | 回/看 | 最后發(fā)表 | |
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 11408 321分求調劑 +3 | huchun12138 2026-03-30 | 4/200 |
|
|---|---|---|---|---|
|
|
[考研] 086502化學工程342求調劑 +7 | 阿姨復古不過 2026-03-27 | 7/350 |
|
|
[考研] 0856，材料與化工321分求調劑 +13 | 大饞小子 2026-03-27 | 14/700 |
|
|
|
[考研] 材料專業(yè)求調劑 +7 | 月月鳥木 2026-04-01 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 初試301，代碼085701環(huán)境工程，本碩一致，四六級已過，有二區(qū)一作，共發(fā)表5篇論文 +3 | axibli 2026-04-01 | 3/150 |
|
|
|
[考博] 26申博 +4 | 加油沖��！ 2026-03-26 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 本科211安全工程，初試290分，求調劑 +3 | 2719846834 2026-03-28 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 287求調劑 +17 | land xuxu 2026-03-26 | 17/850 |
|
|
|
[考研] 266分，求材料相關專業(yè)調劑 +10 | 哇呼哼呼哼 2026-03-30 | 12/600 |
|
|
|
[考研] 一志愿食品科學與工程083200求調劑 +4 | XQTJZ 2026-03-30 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 281求調劑 +5 | 亞克西good 2026-03-26 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 332求調劑 +6 | @MZB382400 2026-03-28 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 303求調劑 +7 | DLkz1314. 2026-03-30 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 一志愿中南大學化學0703總分337求調劑 +6 | niko- 2026-03-27 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 070305高分子化學與物理 304分求調劑 +12 | c297914 2026-03-28 | 12/600 |
|
|
|
[考研] 298求調劑 +3 | 種圣賜 2026-03-29 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 330一志愿中國海洋大學 化學工程 085602 有讀博意愿 求調劑 +3 | wywy.. 2026-03-27 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 一志愿211院校 344分 東北農業(yè)大學生物學學碩，求調劑 +5 | 丶風雪夜歸人丶 2026-03-26 | 8/400 |
|
|
|
[考研] 調劑 +3 | 李嘉圖·S·路 2026-03-27 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 環(huán)境專碩324分求調劑推薦 +5 | 軒小寧—— 2026-03-26 | 5/250 |
|