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電轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)影響因素 已有1人參與
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1 電場(chǎng)參數(shù) 電場(chǎng)是電轉(zhuǎn)染的重要因素，細(xì)胞在電場(chǎng)的作用下，膜通透性增加或是形成小孔，以完成轉(zhuǎn)染過(guò)程。因此電場(chǎng)強(qiáng)度是應(yīng)該被優(yōu)化的主要參數(shù)。電場(chǎng)強(qiáng)度不能過(guò)高，過(guò)高會(huì)增加細(xì)胞的死亡率；也不能過(guò)低，過(guò)低不能增加膜的通透性或在膜上形成小孔。因此，一個(gè)適宜的電場(chǎng)強(qiáng)度至關(guān)重要。 不同細(xì)胞系具有不同的最佳場(chǎng)強(qiáng)值，其確定方法除了實(shí)驗(yàn)直接測(cè)定比較不同場(chǎng)強(qiáng)下轉(zhuǎn)染率的高低外，還可以采取較為簡(jiǎn)便的間接法。文獻(xiàn)顯示存活率在50%左右的電場(chǎng)參數(shù)為理想?yún)?shù)，故可間接測(cè)定存活率來(lái)確定最佳場(chǎng)強(qiáng)值。 2脈沖過(guò)程 1）脈沖波形 脈沖波形主要分為兩種：1、方波脈沖；2、指數(shù)遞減波脈沖。 方波脈沖是指：電壓瞬間升至預(yù)設(shè)電壓，保持電壓放電，然后瞬間終止放電。 一般哺乳動(dòng)物細(xì)胞電轉(zhuǎn)染時(shí)選擇方波脈沖，有較高的轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞存活率。 指數(shù)遞減波脈沖是指：先對(duì)電容充電，然后讓電容完全放電，其電壓變化呈指數(shù)遞減。一般這種波形的脈沖電轉(zhuǎn)染適用于細(xì)菌、酵母菌、昆蟲細(xì)胞。 2）脈沖時(shí)間 脈沖時(shí)間的選定主要取決與脈沖波形。在方波脈沖中，脈沖時(shí)間可直接設(shè)定。在指數(shù)遞減波脈沖中，脈沖時(shí)間是指電壓衰減至初始電壓1/3時(shí)所用的時(shí)間，等于電容（C）與電阻（R）的乘積，單位是ms。在參數(shù)優(yōu)化中，增加電壓應(yīng)當(dāng)降低脈沖時(shí)間，而減小電壓則應(yīng)當(dāng)增大脈沖時(shí)間。 3）脈沖次數(shù) 一般而言，對(duì)于大多數(shù)細(xì)胞類型都選擇單次脈沖。而在有些情況下可能會(huì)用到多次脈沖，因?yàn)榈碗妷�、短脈沖時(shí)間、多次脈沖可有效避免細(xì)胞損傷。多次脈沖建議中間間隔1min。 3細(xì)胞因素 用于電轉(zhuǎn)的細(xì)胞一般選取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞（15代以內(nèi)，傳代后2d）。因?yàn)樘幱趯?duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞分裂旺盛，表面結(jié)構(gòu)致密比穩(wěn)定期的細(xì)胞差，電轉(zhuǎn)后，細(xì)胞膜的恢復(fù)能力強(qiáng)，而且處于有絲分裂期的細(xì)胞更容易接受外源DNA.細(xì)胞懸液濃度一般為1*106/ml，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)密度大于3*106/ml，轉(zhuǎn)染效率會(huì)下降。原因除了細(xì)胞老化外，細(xì)胞過(guò)密會(huì)使相鄰細(xì)胞相互作用增大，甚至使細(xì)胞相互融合，從而導(dǎo)致電場(chǎng)的局部微擾，使電場(chǎng)環(huán)境無(wú)法均一化，細(xì)胞體積越大對(duì)電擊越敏感，所需電場(chǎng)強(qiáng)度也越小。 4 質(zhì)粒因素 從質(zhì)粒濃度看，細(xì)胞密度為1*106/ml，DNA用量在2-5ug/ml轉(zhuǎn)染效率最高。轉(zhuǎn)染率在一定一定范圍內(nèi)隨質(zhì)粒濃度的上升呈線性增高，但是到達(dá)一個(gè)峰值后，隨DNA用量增加而轉(zhuǎn)染率逐漸下降，其原因可能為細(xì)胞吸納DNA有一個(gè)飽和度，過(guò)量便會(huì)產(chǎn)生毒性，使存活率降低，不利于轉(zhuǎn)染率提高。 進(jìn)行小分子量的分子轉(zhuǎn)染時(shí)（siRNA/miRNA），應(yīng)使用高電壓、短脈沖時(shí)間。大分子量分子轉(zhuǎn)染時(shí)（DNA），應(yīng)使用低電壓，長(zhǎng)脈沖時(shí)間。 從質(zhì)粒的純度看，用高純度的DNA才 能提高電轉(zhuǎn)的效率，且應(yīng)注意以下幾點(diǎn)：首先DNA／RNA應(yīng)該超純(A260／A280>1．8)，其次應(yīng)不含內(nèi)毒 素，同時(shí)質(zhì)粒應(yīng)溶于雙蒸水而不是TE緩沖溶液。 5 溫度 一般情況下，電轉(zhuǎn)的過(guò)程是在室溫下進(jìn)行，但在 電擊前后可對(duì)細(xì)胞進(jìn)行冰浴處理。電擊前冰浴的時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)染率影響不大，但低溫環(huán)境能夠防止DNA被外源性DNA酶降解，并限制在電擊中因Joule作用而產(chǎn)生的不良反應(yīng)，因此，實(shí)驗(yàn)一般選擇電擊前冰浴5min。電擊后冰浴，會(huì)影響DNA攝入，因?yàn)殡姄艉蟊】稍鰪?qiáng)細(xì)胞收縮，細(xì)胞膜上的 電穿孔封閉較慢，延長(zhǎng)外源性DNA攝入時(shí)間，從而提高其攝入量。在室溫環(huán)境下，雖然細(xì)胞膜上的孔 封閉速度快，但在隨后2h，質(zhì)粒還可通過(guò)電內(nèi)化進(jìn)入細(xì)胞，因此攝人量不一定比4℃環(huán)境下低。而且，室溫下細(xì)胞在5 min內(nèi)即閉孔，在4℃的環(huán)境下穿孔狀態(tài)可保持4h，穿孔封閉緩慢降低了存活率，同時(shí)細(xì)胞在低溫下更容易受到損傷。 因此，綜合考慮攝人量和存活率，大部分文獻(xiàn)傾向于電擊后細(xì)胞仍在室溫或37℃下保存。 6電轉(zhuǎn)染試劑的選擇 電擊會(huì)對(duì)細(xì)胞造成一定程度的傷害，在轉(zhuǎn)染試劑的選擇上要注意，應(yīng)選擇具有細(xì)胞膜修復(fù)成分的電轉(zhuǎn)染試劑，如Entranster-E，將電擊對(duì)細(xì)胞的損傷降到最低。 7電轉(zhuǎn)后培養(yǎng)液的選擇 細(xì)胞在電擊后十分脆弱，其 培養(yǎng)液的選擇應(yīng)注重提高細(xì)胞的存活率，一般選擇 低滲的RPMI 1640+10％FCS。除此之外，可參考 加入50 mmol／L海藻糖+1.25％DMSO，因?yàn)楹Ｔ?糖具有穩(wěn)定DNA、蛋白質(zhì)以及細(xì)胞膜的作用，并提高電轉(zhuǎn)后細(xì)胞特別是淋巴細(xì)胞的存活率。此外， 有文獻(xiàn)顯示凋亡是細(xì)胞電擊后死亡的主要原因，電 擊后的培養(yǎng)液還可加入Caspase抑制劑和SCFGM-CSF等細(xì)胞因子。 |
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分子-黃雁
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小木蟲: 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖
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您好，我現(xiàn)在做的是將5000bp的回補(bǔ)質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入嗜水氣單胞菌的突變株中，因?yàn)槭堑谝淮谓佑|，希望您能給些建議，謝謝 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
2樓2019-05-14 17:10:18
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