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siRNA轉(zhuǎn)染實驗注意事項 已有1人參與
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為了達到高的轉(zhuǎn)染效率，在轉(zhuǎn)染實驗過程中，需要注意以下幾點： 1.純化siRNA siRNA的濃度和純度對轉(zhuǎn)染實驗非常重要。為得到高純度的siRNA，推薦用玻璃纖維結(jié)合，洗脫或通過15-20%丙烯酰胺膠除去反應(yīng)中多余的核苷酸，小的寡核苷酸，蛋白和鹽離子。注意：化學合成的RNA通常需要跑膠電泳純化（即PAGE膠純化）。 2.避免RNA酶污染 微量的RNA酶將導(dǎo)致siRNA轉(zhuǎn)染實驗失敗。由于實驗環(huán)境中RNA酶普遍存在，如皮膚，頭發(fā)，所有徒手接觸過的物品或暴露在空氣中的物品等，因此保證實驗中的每個環(huán)節(jié)不受RNA酶污染非常重要。 3.健康的細胞培養(yǎng)物和嚴格的操作確保轉(zhuǎn)染的重復(fù)性 通常，健康的細胞轉(zhuǎn)染效率較高。此外，較低的傳代數(shù)能確保每次實驗所用細胞的穩(wěn)定性。為了優(yōu)化實驗，推薦用50代以下的轉(zhuǎn)染細胞，否則細胞轉(zhuǎn)染效率會隨時間明顯下降。 4.選擇合適的轉(zhuǎn)染試劑 針對siRNA制備方法以及靶細胞類型的不同，選擇好的轉(zhuǎn)染試劑和優(yōu)化的操作對siRNA實驗的成功至關(guān)重要。如Entranster-R4000，專門針對siRNA等RNA轉(zhuǎn)染。 5.通過合適的陽性對照優(yōu)化轉(zhuǎn)染和檢測條件 對大多數(shù)細胞，看家基因是較好的陽性對照。將不同濃度的陽性對照的siRNA轉(zhuǎn)入靶細胞（同樣適合實驗靶siRNA），轉(zhuǎn)染48小時后統(tǒng)計對照蛋白或mRNA相對于未轉(zhuǎn)染細胞的降低水平。過多的siRNA將導(dǎo)致細胞毒性以至死亡。 6.通過標記siRNA來優(yōu)化實驗 熒光標記的siRNA能用來分析siRNA穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)染效率。標記的siRNA還可用作siRNA胞內(nèi)定位及雙標記實驗（配合標記抗體）來追蹤轉(zhuǎn)染過程中導(dǎo)入了siRNA的細胞，將轉(zhuǎn)染與靶蛋白表達的下調(diào)結(jié)合起來。 |
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2樓2019-05-07 13:44:23
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