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MTT原理 MTT全稱(chēng)為3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide，是一種黃顏色的染料。活細(xì)胞線粒體中琥珀酸脫氫酶能夠代謝還原MTT，同時(shí)在細(xì)胞色素C的作用下，生成藍(lán)色（或藍(lán)紫色）不溶于水的甲臜（Formazan），甲臜的多少可以用酶標(biāo)儀在570nm 處進(jìn)行測(cè)定。在通常情況下，甲臜生成量與活細(xì)胞數(shù)成正比，因此可根據(jù)光密度OD值推測(cè)出活細(xì)胞的數(shù)目。由于死細(xì)胞中不含琥珀酸脫氫酶，因此加入MTT 不會(huì)有反應(yīng)。 MTT 溶液的配制方法 通常，此法中的MTT 濃度為5mg/ml。因此，可以稱(chēng)取MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸緩沖液（PBS）或無(wú)酚紅的培養(yǎng)基中，用0.22μm濾膜過(guò)濾以除去溶液里的細(xì)菌，放4℃ 避光保存即可。在配制和保存的過(guò)程中，容器最好用鋁箔紙包住。 需要注意的是，MTT法只能用來(lái)檢測(cè)細(xì)胞相對(duì)數(shù)和相對(duì)活力，但不能測(cè)定細(xì)胞絕對(duì)數(shù)。在用酶標(biāo)儀檢測(cè)結(jié)果的時(shí)候，為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的線性，MTT 吸光度最好在0-0.7 范圍內(nèi)。 實(shí)驗(yàn)方法 This procedure is for cells in 96 well plates, if larger plates are used then adjust volumes accordingly. 1. Make a solution of 5mg/ml MTT dissolved in PBS and filter sterilise through a 0.2µM filter and stored at 2-8℃（can be stored for 3 months). 2. 5 hours before the end of the incubation, add 20 µl of MTT solution from step one to each well containing cells. 3. Incubate the plate at 37℃ for 4-5 hours. 4. Remove media with needle and syringe. 5. Add 150 µl(or 200 µl) of DMSO to each well and pipette up and down to dissolve crytals. 6. Put plate into the incubator for 5min to dissovle air bubbles. Transfer to plate reader and measure absorbance at wavelength between 500 and 600 nm(usually 570nm or 550nm). |
2樓2009-07-23 16:31:12
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