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細菌基因組DNA的提取方法綜述
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細菌基因組DNA的提取方法綜述，提供了5種方法。 1 快速微量提取法 A.取1.5ml菌體培養(yǎng)物于一滅菌Ep管中，12000rpm離心1min, 丟去上清夜，收集菌體。 B.加入400ul裂解液（40mMTris-醋酸，20mM醋酸鈉,1mMEDTA,1%SDS,pH7.8）混勻,置于37oC水浴1hr。 C.然后加入200ul5mol/L的氯化鈉溶液，混勻后于13000rpm離心15min。 D.取上清液，用苯酚抽提2次，氯仿抽提1次。 E.加兩倍體積無水乙醇，1/10體積醋酸鉀(3M ,pH8.0)，-20度保存1小時后，13000rpm離心15min，棄上清液，沉淀用70%乙醇洗2次；置于室溫干燥后，溶于50ulTE溶液中，置4oC保存?zhèn)溆谩?br /> 2 蛋白酶/SDS法制備 先用10ml含適當抗生素的GBM過夜培養(yǎng)Delftia sp.，第二天4000rpm離心10min收集菌體，用Washing TE（50mmol/LTris-HCl pH8.0,10mmol/LEDTA pH8.0）洗菌體2次，之后將菌體充分懸浮在5ml 1×TE緩沖液中，先后加入0.5ml 5mg/L的蛋白酶、0.5ml 10% SDS，輕輕混勻后50℃放置3h~5h，接著用等體積的Tris飽和苯酚抽提2次，苯酚/氯仿/異戊醇抽提一次，氯仿抽提一次后，乙醇沉淀DNA，用自動移液器吸管頭將絮狀DNA沉淀塊吸附到Ep管中，70%乙醇洗2次，干燥后溶于適當1×TE或ddH2O中。 3 1) 細菌培養(yǎng)：細菌接種于5ml液體培養(yǎng)基中，37℃搖床（300rpm）培養(yǎng)過液。 2) 細菌收集：取1ml培養(yǎng)物于1.5ml EP管中，室溫8000rpm離心5min，棄上清，沉淀重新懸浮于1ml TE（pH8.0）中（用ddH2O也行)。 3) 菌體裂解：加入6μl 50mg/ml的溶菌酶，37℃作用2h。再加2mol/LNaCl50μl，10%SDS 110μl，20mg/ml的蛋白酶K 3μl，50℃作用3h或37℃過夜。（此時菌液應為透明粘稠液體） 4) 抽提：菌液均分到兩個1.5ml EP管，加等體積的酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)，混勻，室溫放置5-10min。12000rpm離心10min。抽提兩次。（上清很粘稠，吸取時應小心，最好槍頭尖應剪去） 5) 沉淀：加0.6倍體積的異丙醇，混勻，室溫放置10min。1 2000rpm離心10min。 6)洗滌：沉淀用75%的乙醇洗滌。 7) 抽（涼）干后，溶于50μl ddH2O中，取2-5μl電泳。作PCR模板用。 4 DNA EXTRACTION PROCEDURE - GENERAL 1) Grow cells overnight in 500 ml broth medium. 2) Pellet cells by centrifugation, and resuspend in 5 ml 50 mM Tris (pH 8.0), 50 mM EDTA. 3) Freeze cell suspension at -20C 4) Add 0.5 ml 250 mM Tris (pH 8.0), 10 mg/ml lysozyme to frozen suspension, and let thaw at room temperature. When thawed, place on ice for 45 min. 5) Add 1 ml 0.5% SDS, 50 mM Tris (pH 7.5), 0.4 M EDTA, 1 mg/ml proteinase K. Place in 50C water bath for 60 min. 6) Extract with 6 ml Tris-equilibrated phenol and centrifuge at 10,000X g for 15 min. Transfer top layer to new tube (avoid interface). Re-do this step if necessary. 7) Add 0.1 vol 3M Na acetate (mix gently), then add 2 vol 95% ethanol (mix by inverting). Spool out DNA and transfer to 5 ml 50 mM Tris (pH 7.5), 1 mM EDTA, 200 g/ml RNase. Dissolve overnight by rocking at 4C. 8) Extract with equal volume chloroform (mix by inverting) and centrifuge at 10,000X g for 5 min. Transfer top layer to a new tube. 9) Add 0.1 vol 3M Na acetate (mix gently), then add 2 vol 95% ethanol (mix by inverting). 10) Spool out DNA and dissolve in 2 ml 50 mM Tris (pH 7.5), 1 mM EDTA. 11) Check purity of DNA by electrophoresis and spectrophotometric analysis. 5 1) 100ml 細菌過夜培養(yǎng)液, 5000rpm離心10分鐘, 去上清液。 2) 加9.5ml TE懸浮沉淀, 并加0.5ml 10% SDS, 50μl 20mg/ml(或1mg干粉)蛋白酶 K, 混勻, 37℃保溫1小時。 3) 加1.5ml 5mol/L NaCl, 混勻。 4) 加1.5ml CTAB/NaCl溶液, 混勻, 65℃保溫20分鐘。 5) 用等體積酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)抽提, 5000rpm離心10分鐘, 將上清液移至干凈離心管。 6) 用等體積氯仿:異戊醇(24:1)抽提, 取上清液移至干凈管中。 7) 加1倍體積異丙醇, 顛倒混合, 室溫下靜止10分鐘，沉淀DNA。 8) 用玻棒撈出DNA沉淀, 70%乙醇漂洗后, 吸干,溶解于1ml TE, -20℃保存。如DNA沉淀無法撈出,可5000rpm離心, 使DNA沉淀。 9) 如要除去其中的RNA, 可以按本章第三節(jié)中操作步驟處理。 注：1)CTAB/NaCl溶液：4.1g NaCl溶解于80ml H2 O,緩慢加入10g CTAB,加水至100ml。 2)氯仿:異戊醇(24:1)，酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)，異丙醇，70% 乙醇，TE，10% SDS，蛋白酶 K (20mg/ml或粉劑)，5mol/L NaCl。 |
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ericexist
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4樓2005-12-18 18:43:26
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