 |
 |
 |
 |
 |
 |
||
 |
 |
 |
 |
 |
| 5 | 1/1 | 返回列表 |
| 查看: 1358 | 回復(fù): 3 | |||
| 當(dāng)前主題已經(jīng)存檔。 | |||
| 當(dāng)前只顯示滿足指定條件的回帖，點(diǎn)擊這里查看本話題的所有回帖 | |||
[交流]
細(xì)菌基因組DNA的提取方法綜述
|
|||
|
細(xì)菌基因組DNA的提取方法綜述，提供了5種方法。 1 快速微量提取法 A.取1.5ml菌體培養(yǎng)物于一滅菌Ep管中，12000rpm離心1min, 丟去上清夜，收集菌體。 B.加入400ul裂解液（40mMTris-醋酸，20mM醋酸鈉,1mMEDTA,1%SDS,pH7.8）混勻,置于37oC水浴1hr。 C.然后加入200ul5mol/L的氯化鈉溶液，混勻后于13000rpm離心15min。 D.取上清液，用苯酚抽提2次，氯仿抽提1次。 E.加兩倍體積無水乙醇，1/10體積醋酸鉀(3M ,pH8.0)，-20度保存1小時(shí)后，13000rpm離心15min，棄上清液，沉淀用70%乙醇洗2次；置于室溫干燥后，溶于50ulTE溶液中，置4oC保存?zhèn)溆谩?br /> 2 蛋白酶/SDS法制備 先用10ml含適當(dāng)抗生素的GBM過夜培養(yǎng)Delftia sp.，第二天4000rpm離心10min收集菌體，用Washing TE（50mmol/LTris-HCl pH8.0,10mmol/LEDTA pH8.0）洗菌體2次，之后將菌體充分懸浮在5ml 1×TE緩沖液中，先后加入0.5ml 5mg/L的蛋白酶、0.5ml 10% SDS，輕輕混勻后50℃放置3h~5h，接著用等體積的Tris飽和苯酚抽提2次，苯酚/氯仿/異戊醇抽提一次，氯仿抽提一次后，乙醇沉淀DNA，用自動(dòng)移液器吸管頭將絮狀DNA沉淀塊吸附到Ep管中，70%乙醇洗2次，干燥后溶于適當(dāng)1×TE或ddH2O中。 3 1) 細(xì)菌培養(yǎng)：細(xì)菌接種于5ml液體培養(yǎng)基中，37℃搖床（300rpm）培養(yǎng)過液。 2) 細(xì)菌收集：取1ml培養(yǎng)物于1.5ml EP管中，室溫8000rpm離心5min，棄上清，沉淀重新懸浮于1ml TE（pH8.0）中（用ddH2O也行)。 3) 菌體裂解：加入6μl 50mg/ml的溶菌酶，37℃作用2h。再加2mol/LNaCl50μl，10%SDS 110μl，20mg/ml的蛋白酶K 3μl，50℃作用3h或37℃過夜。（此時(shí)菌液應(yīng)為透明粘稠液體） 4) 抽提：菌液均分到兩個(gè)1.5ml EP管，加等體積的酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)，混勻，室溫放置5-10min。12000rpm離心10min。抽提兩次。（上清很粘稠，吸取時(shí)應(yīng)小心，最好槍頭尖應(yīng)剪去） 5) 沉淀：加0.6倍體積的異丙醇，混勻，室溫放置10min。1 2000rpm離心10min。 6)洗滌：沉淀用75%的乙醇洗滌。 7) 抽（涼）干后，溶于50μl ddH2O中，取2-5μl電泳。作PCR模板用。 4 DNA EXTRACTION PROCEDURE - GENERAL 1) Grow cells overnight in 500 ml broth medium. 2) Pellet cells by centrifugation, and resuspend in 5 ml 50 mM Tris (pH 8.0), 50 mM EDTA. 3) Freeze cell suspension at -20C 4) Add 0.5 ml 250 mM Tris (pH 8.0), 10 mg/ml lysozyme to frozen suspension, and let thaw at room temperature. When thawed, place on ice for 45 min. 5) Add 1 ml 0.5% SDS, 50 mM Tris (pH 7.5), 0.4 M EDTA, 1 mg/ml proteinase K. Place in 50C water bath for 60 min. 6) Extract with 6 ml Tris-equilibrated phenol and centrifuge at 10,000X g for 15 min. Transfer top layer to new tube (avoid interface). Re-do this step if necessary. 7) Add 0.1 vol 3M Na acetate (mix gently), then add 2 vol 95% ethanol (mix by inverting). Spool out DNA and transfer to 5 ml 50 mM Tris (pH 7.5), 1 mM EDTA, 200 g/ml RNase. Dissolve overnight by rocking at 4C. 8) Extract with equal volume chloroform (mix by inverting) and centrifuge at 10,000X g for 5 min. Transfer top layer to a new tube. 9) Add 0.1 vol 3M Na acetate (mix gently), then add 2 vol 95% ethanol (mix by inverting). 10) Spool out DNA and dissolve in 2 ml 50 mM Tris (pH 7.5), 1 mM EDTA. 11) Check purity of DNA by electrophoresis and spectrophotometric analysis. 5 1) 100ml 細(xì)菌過夜培養(yǎng)液, 5000rpm離心10分鐘, 去上清液。 2) 加9.5ml TE懸浮沉淀, 并加0.5ml 10% SDS, 50μl 20mg/ml(或1mg干粉)蛋白酶 K, 混勻, 37℃保溫1小時(shí)。 3) 加1.5ml 5mol/L NaCl, 混勻。 4) 加1.5ml CTAB/NaCl溶液, 混勻, 65℃保溫20分鐘。 5) 用等體積酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)抽提, 5000rpm離心10分鐘, 將上清液移至干凈離心管。 6) 用等體積氯仿:異戊醇(24:1)抽提, 取上清液移至干凈管中。 7) 加1倍體積異丙醇, 顛倒混合, 室溫下靜止10分鐘，沉淀DNA。 8) 用玻棒撈出DNA沉淀, 70%乙醇漂洗后, 吸干,溶解于1ml TE, -20℃保存。如DNA沉淀無法撈出,可5000rpm離心, 使DNA沉淀。 9) 如要除去其中的RNA, 可以按本章第三節(jié)中操作步驟處理。 注：1)CTAB/NaCl溶液：4.1g NaCl溶解于80ml H2 O,緩慢加入10g CTAB,加水至100ml。 2)氯仿:異戊醇(24:1)，酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)，異丙醇，70% 乙醇，TE，10% SDS，蛋白酶 K (20mg/ml或粉劑)，5mol/L NaCl。 |
回復(fù)此樓» 猜你喜歡
309求調(diào)劑
已經(jīng)有8人回復(fù)
-
一志愿南航 335分 | 0856 | GPA 4.07 | 有科研經(jīng)歷
已經(jīng)有8人回復(fù)
-
求調(diào)劑
已經(jīng)有5人回復(fù)
-
求化學(xué)調(diào)劑
已經(jīng)有5人回復(fù)
-
085600，材料與化工321分求調(diào)劑
已經(jīng)有10人回復(fù)
-
0703 化學(xué) 求調(diào)劑，一志愿山東大學(xué) 342 分
已經(jīng)有5人回復(fù)
-
一志愿南開大學(xué)0710生物學(xué)359求調(diào)劑
已經(jīng)有3人回復(fù)
-
085600，專業(yè)課化工原理，320分求調(diào)劑
已經(jīng)有4人回復(fù)
-
材料與化工272求調(diào)劑
已經(jīng)有16人回復(fù)
-
290求調(diào)劑
已經(jīng)有3人回復(fù)
ericexist
木蟲 (正式寫手)
- 應(yīng)助: 0 (幼兒園)
- 金幣: 2270.9
- 帖子: 797
- 在線: 61.6小時(shí)
- 蟲號(hào): 116216
- 注冊: 2005-11-25
- 性別: GG
- 專業(yè): 衰老與生物節(jié)律
4樓2005-12-18 18:43:26
3樓2005-12-18 14:50:14
| 最具人氣熱帖推薦 [查看全部] | 作者 | 回/看 | 最后發(fā)表 | |
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 322求調(diào)劑：一志愿湖南大學(xué) 材料與化工（085600），已過六級(jí)。 +4 | XX小鄧 2026-03-29 | 4/200 |
|
|---|---|---|---|---|
|
|
[考研] 本科雙非材料，跨考一志愿華電085801電氣，283求調(diào)劑，任何專業(yè)都可以 +6 | 芝士雪baoo 2026-03-28 | 8/400 |
|
|
[考研] 一志愿211 初試270分 求調(diào)劑 +8 | 谷雨上岸 2026-03-23 | 9/450 |
|
|
|
[考研] 一志愿太原理工安全工程300分，求調(diào)劑 +5 | 0857求調(diào)劑. 2026-03-24 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 一志愿華北電力大學(xué)能動(dòng)專碩，293，求調(diào)劑 +3 | 15537177284 2026-03-23 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 0703化學(xué)/290求調(diào)劑/本科經(jīng)歷豐富/工科也可 +9 | 丹青奶蓋 2026-03-26 | 10/500 |
|
|
|
[考研] 0703化學(xué)求調(diào)劑，各位老師看看我！��！ +5 | 祁祺祺 2026-03-25 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 07化學(xué)280分求調(diào)劑 +10 | 722865 2026-03-23 | 10/500 |
|
|
|
[考研] 322求調(diào)劑 +4 | 我真的很想學(xué)習(xí) 2026-03-23 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 考研調(diào)劑 +10 | 呼呼？~+123456 2026-03-24 | 10/500 |
|
|
|
[考研] 292求調(diào)劑 +4 | 求求了收下我吧?/a> 2026-03-26 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 求調(diào)劑323材料與化工 +7 | 1124361 2026-03-24 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 333求調(diào)劑 +6 | wfh030413@ 2026-03-23 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 081700 調(diào)劑 267分 +11 | 迷人的哈哈 2026-03-23 | 11/550 |
|
|
|
[考研] 07化學(xué)303求調(diào)劑 +5 | 睿08 2026-03-25 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 材料與化工304求B區(qū)調(diào)劑 +3 | 邱gl 2026-03-25 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 考研一志愿蘇州大學(xué)初始315（英一）求調(diào)劑 +3 | sbdksD 2026-03-24 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 【2026考研調(diào)劑】制藥工程 284分 求相關(guān)專業(yè)調(diào)劑名額 +4 | 袁奐奐 2026-03-25 | 8/400 |
|
|
|
[考研] 求調(diào)劑 +3 | 李李不服輸 2026-03-25 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 材料專碩找調(diào)劑 +5 | 哈哈哈吼吼吼哈 2026-03-23 | 5/250 |
|