 |
 |
 |
 |
 |
 |
||
 |
 |
 |
 |
 |
| 1 | 1/1 | 返回列表 |
| 查看: 493 | 回復: 0 | |||
科研小努力新蟲 (小有名氣)
|
[交流]
破骨細胞的傳代、凍存與復蘇
|
|
實驗動物：成年SPF級雄性SD大鼠1只， 體重250g。 實驗方法及步驟 1、外周血單個核細胞分離 （1）標本采集：取SPF 成年 SD 大鼠 1 只，3％戊巴比妥鈉，按動物體重0.15 ml/100g，腹腔注射麻醉。無菌操作下腹主動脈采血6 ml，注入肝素抗凝管中。 （2）單個核細胞分離：采用密度梯度離心法， 向采集的血樣標本內(nèi)加入等量的PBS，取4支15ml離心管，分別加入大鼠淋巴細胞分離液各3ml，再緩緩向各離心管內(nèi)加入上述含PBS血樣各3ml，然后以2000r／min，水平離心20min，取出后在絮狀層小心吸取單個核細胞，分別收集到2支離心管中，PBS清洗2次，備作重懸培養(yǎng)。 2、破骨細胞的誘導培養(yǎng) 將分離純化的大鼠周圍血單個核細胞，用含10％FBS、50ng／mlRANKL、20ng ／mlM－CSF、100U／ml青霉素、100U／ml鏈霉素的 α－MEM培養(yǎng)液重懸，調(diào)整細胞密度為1×105個／ml。再將配制好的細胞懸液接種到6孔培養(yǎng)板與直徑35 mm培養(yǎng)皿中。直徑35mm培養(yǎng)皿用于活細胞工作站動態(tài)跟蹤成像，6孔培養(yǎng)板置 于CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，在37℃、5％CO2、飽和濕度下連續(xù)培養(yǎng)，用上述含RANKL、M－CSF的α-MEM 培養(yǎng)液換液，每3日1次。同時對整個培養(yǎng)過程作相差顯微鏡觀察與活細胞成像，培養(yǎng)14 d作抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色。 3、破骨細胞的傳代 大鼠周圍血單個核細胞經(jīng)RANKL、M－CSF 誘導培養(yǎng)2周，形成大量貼壁的多核破骨細胞后，從培養(yǎng)箱中取出，將培養(yǎng)液吸凈，加入37 ℃預溫的D－Hank＇s液，沖洗2次，再滴加足量的0.25％胰蛋白酶液，使其覆蓋整個底面，置于37 ℃培養(yǎng)箱中消化5min后取出，震蕩1min左右，在倒置相差顯微鏡下觀察，當大部分細胞收縮懸起后，加入α－MEM完全培養(yǎng)液終止消化，用吸管反復抽吸吹打，將細胞混勻后移入15ml離心管，2000r／min，離心5min，去上清，用含RANKL、M－CSF的α－MEM完全培養(yǎng)液重懸細胞， 調(diào)整濃度至1×105個／ml，接種細胞至6孔培養(yǎng)板與直徑35mm 培養(yǎng)皿中。同時對消化與貼壁過程作活細胞成像觀察，3d后作TRAP染色。 4、破骨細胞的凍存 按破骨細胞傳代方法，將誘導培養(yǎng)的破骨細胞制成細胞懸液，2000r／min，離心5min，去上清，用DMSO、FBS、α－MEM 按1∶2∶7 比例配制的凍存液，重懸細胞，調(diào)整細胞濃度至5×106個／ml，加入凍存管，每支1.5ml，用凍存罐在溫度為－80℃冰箱中放置24h，再移至－196 ℃液氮中凍存。 5、破骨細胞的復蘇 從液氮中取出凍存的破骨細胞，迅速在 37 ℃水浴中震蕩融解，將融解的細胞懸液加入15ml離心管中，再加6ml α－MEM完全培養(yǎng)液，混勻，2000r／min，離心5min，去上清，用含RANKL、M－CSF 的α －MEM完全培養(yǎng)液，按1×105個／ ml的細胞濃度重懸后，分別接種到6孔培養(yǎng)板與直徑35mm培養(yǎng)皿中。同時對接種后的貼壁過程作活細胞成像觀察，3d后作TRAP染色。 觀察項目與方法 1、活細胞成像觀察 （1）破骨細胞誘導培養(yǎng)的活細胞成像 觀察：取直徑35mm培養(yǎng)皿，將其置于活細胞工作站倒置顯微鏡的培養(yǎng)室中，在相差觀察模式、20倍物鏡下，以1f／6s的采集速度，對整個培養(yǎng)過程作序列圖像捕獲，進行單幀圖像分析與縮時視頻動態(tài)觀察。 （2）破骨細胞傳代培養(yǎng)的活細胞成像 觀察：取直徑35mm培養(yǎng)皿培養(yǎng)的破骨細胞，將其置于活細胞工作站倒置顯微鏡的培養(yǎng)室中，在相差觀察模式、20倍物鏡下，選擇貼壁良好，胞質(zhì)充分展開，細胞核清晰可見的多核破骨細胞，調(diào)整到視野中心，然后將培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液吸凈，再用 37℃預溫的D－h(huán)ank＇s 液緩緩沖洗2遍，吸干。 以1 f／s的采集速度，開始序列圖像捕獲，同時向培養(yǎng)皿內(nèi)加入1ml 0.25％胰蛋白酶溶液，記錄破骨細胞在胰蛋白酶作用下的整個消化過程，約5min。當細胞胞體收縮，呈飽滿圓亮、半懸浮狀態(tài)時，加入2ml α－MEM 完全培養(yǎng)液終止消化，用吸管吹吸，使其形成均勻的細胞懸液，再移入2ml滅菌EP管，2000r／min離心3min，去上清，用含 RANKL、M－CSF 的α－MEM完全培養(yǎng)液重懸細胞，接種到另一個直徑35 mm培養(yǎng)皿，放回活細胞工作站的培養(yǎng)室中，再按上述方法選擇圓亮飽滿、體積較大的多核破骨細胞，置于觀察視野中心，以1f／6s采集速度進行序列圖像采集，觀察破骨細胞傳代后的整個貼壁過程。 （3）破骨細胞復蘇培養(yǎng)的活細胞成像 觀察：破骨細胞復蘇培養(yǎng)后，立即取直徑35mm培養(yǎng)皿培養(yǎng)的破骨細胞置于活細胞工作站的培養(yǎng)室中，按上述破骨細胞傳代后的活細胞成像觀察方法，進行序列圖像采集，觀察破骨細胞復蘇培養(yǎng)后的整個貼壁過程。 2、TRAP染色 取培養(yǎng)細胞，吸凈孔內(nèi)培養(yǎng)液，用37 ℃預溫的PBS沖洗2次，再用2.5％戊二醛常溫下固定2min，去離子水漂洗3次。取堅牢石榴紅GBC溶液0.1ml和亞硝酸鹽溶液0.1ml，輕輕混合30s，靜止2min。將上液加入到9ml 預熱至37 ℃的去離子水中，再依次加入0.1ml萘酚AS－BI磷酸鹽溶液、0.4ml 醋酸鹽溶液、0.2ml 酒石酸鹽溶液，制得染色液。將染色液加入培養(yǎng)孔內(nèi)，37℃孵育，注意避光。15min后觀察染色效果，呈最佳效果時即終止染色，取出后去離子水沖洗，晾干，倒置顯微鏡下觀察，DP-72 數(shù)字成像系統(tǒng)采集圖像。 |
回復此樓» 猜你喜歡
346求調(diào)劑[0856]
已經(jīng)有7人回復
-
一志愿山大07化學 332分 四六級已過 本科山東雙非 求調(diào)劑！
已經(jīng)有3人回復
-
310求調(diào)劑
已經(jīng)有3人回復
-
機械專碩299求調(diào)劑至材料
已經(jīng)有4人回復
-
070300化學319求調(diào)劑
已經(jīng)有7人回復
-
08工科 320總分 求調(diào)劑
已經(jīng)有6人回復
-
一志愿天津大學化學工藝專業(yè)（081702）315分求調(diào)劑
已經(jīng)有12人回復
-
307求調(diào)劑
已經(jīng)有3人回復
-
265求調(diào)劑
已經(jīng)有3人回復
-
301求調(diào)劑
已經(jīng)有10人回復
相關(guān)版塊跳轉(zhuǎn)
我要訂閱樓主 科研小努力 的主題更新
| 1 | 1/1 | 返回列表 |
| 最具人氣熱帖推薦 [查看全部] | 作者 | 回/看 | 最后發(fā)表 | |
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 303求調(diào)劑 +5 | 睿08 2026-03-17 | 7/350 |
|
|---|---|---|---|---|
|
|
[考研] 296求調(diào)劑 +6 | www_q 2026-03-18 | 10/500 |
|
|
|
[考研] 295求調(diào)劑 +4 | 一志愿京區(qū)211 2026-03-18 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 288求調(diào)劑 +16 | 于海海海海 2026-03-19 | 16/800 |
|
|
[考研] 一志愿 西北大學 ，070300化學學碩，總分287，雙非一本，求調(diào)劑。 +4 | 晨昏線與星海 2026-03-19 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 0703化學調(diào)劑 ，六級已過，有科研經(jīng)歷 +13 | 曦熙兮 2026-03-15 | 13/650 |
|
|
|
[考研] 0856調(diào)劑，是學校就去 +8 | sllhht 2026-03-19 | 9/450 |
|
|
|
[考研] 材料學碩318求調(diào)劑 +5 | February_Feb 2026-03-19 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 081700化工學碩調(diào)劑 +3 | 【1】 2026-03-16 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 085600材料與化工調(diào)劑 324分 +10 | llllkkkhh 2026-03-18 | 12/600 |
|
|
|
[考研] 材料考研調(diào)劑 +3 | xwt。 2026-03-19 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 328求調(diào)劑，英語六級551，有科研經(jīng)歷 +4 | 生物工程調(diào)劑 2026-03-16 | 12/600 |
|
|
|
[考研] 收復試調(diào)劑生 +4 | 雨后秋荷 2026-03-18 | 4/200 |
|
|
|
[考研]
 0854，計算機類招收調(diào)劑
+3
|
胡辣湯放糖 2026-03-15 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 材料專碩326求調(diào)劑 +6 | 墨煜姒莘 2026-03-15 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 085601求調(diào)劑 +4 | Du.11 2026-03-16 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 290求調(diào)劑 +3 | p asserby. 2026-03-15 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 0854控制工程 359求調(diào)劑 可跨專業(yè) +3 | 626776879 2026-03-14 | 9/450 |
|
|
|
[考研] 求老師收留調(diào)劑 +4 | jiang姜66 2026-03-14 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 085601材料工程315分求調(diào)劑 +3 | yang_0104 2026-03-15 | 3/150 |
|