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YX科研小助理新蟲 (小有名氣)
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[交流]
線粒體功能障礙通過HIF-1α介導(dǎo)的糖酵解重編程促進前體細(xì)胞向終末衰竭 T 細(xì)胞過渡
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急性感染后，CD8+ T細(xì)胞增殖并分化為細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(ctl)以消除感染的靶細(xì)胞。ctl的分化與轉(zhuǎn)錄、表觀遺傳和代謝重組相平行，以支持其克隆擴增和效應(yīng)功能，如細(xì)胞因子分泌和細(xì)胞毒性。在病原體被清除和炎癥消退后，大多數(shù)效應(yīng)T細(xì)胞死亡，只有少數(shù)淋巴細(xì)胞作為長期記憶T細(xì)胞保留下來。 然而，當(dāng)抗原不能被消除時，例如在持續(xù)性感染和癌癥中，持續(xù)的抗原受體刺激會驅(qū)動另一種分化軌跡，即T細(xì)胞耗竭。耗竭的T (Tex)細(xì)胞在表型上表現(xiàn)為PD-1、Tim-3和Lag-3等共抑制受體的上調(diào)，在功能上表現(xiàn)為細(xì)胞因子分泌和細(xì)胞溶解活性的下降。盡管在終末分化過程中，特克斯細(xì)胞會失去增殖能力并發(fā)生凋亡，但它們會被一個獨特的多能細(xì)胞群體穩(wěn)定地補充，這些細(xì)胞被稱為耗盡的T (Tpex)細(xì)胞的前體細(xì)胞(或祖細(xì)胞)。Tpex細(xì)胞可以通過表達(dá)記憶相關(guān)分子，如轉(zhuǎn)錄因子TCF-1和細(xì)胞表面分子Ly108和CD62L來識別，但沒有終端分化標(biāo)記，如Tim-3和CD160。Tpex細(xì)胞的“干樣”自我更新能力及其在慢性感染小鼠的過繼轉(zhuǎn)移后優(yōu)越的再生潛力激發(fā)了越來越多的科學(xué)興趣，以確定控制從多能Tpex向功能失調(diào)的Tex細(xì)胞轉(zhuǎn)變的分子機制。這個問題也與臨床相關(guān)，因為Tpex細(xì)胞是治療性檢查點阻斷后抗腫瘤免疫反應(yīng)的主要介質(zhì)。雖然PD-1在Tpex和終末耗竭的T細(xì)胞上都有表達(dá)，但只有Tpex細(xì)胞對抗PD-1治療有有效的反應(yīng)，表現(xiàn)為增殖爆發(fā)和分化為細(xì)胞毒性T細(xì)胞，從而在接受檢查點免疫治療的患者中重新激活抗腫瘤免疫反應(yīng)。然而，維持Tpex細(xì)胞干性的分子機制和指示其功能衰竭的信號仍不完全清楚，值得進一步研究以改善癌癥免疫治療的臨床結(jié)果。 研究概要： T細(xì)胞衰竭是癌癥和持續(xù)性感染的標(biāo)志，其特征是抑制性受體上調(diào)、細(xì)胞因子分泌減少和細(xì)胞溶解活性受損。最終耗竭的T細(xì)胞由前體細(xì)胞群(Tpex)穩(wěn)定地補充，但是控制Tpex維持的代謝原理和控制其耗竭的調(diào)節(jié)回路仍然不完全清楚。通過結(jié)合基因缺陷小鼠、單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)分析，我們發(fā)現(xiàn)線粒體功能不足是啟動T細(xì)胞功能衰竭的細(xì)胞內(nèi)在觸發(fā)因素。在分子水平上，我們發(fā)現(xiàn)線粒體功能障礙引起氧化還原應(yīng)激，從而抑制缺氧誘導(dǎo)因子1α (HIF-1α)的蛋白酶體降解，并促進Tpex細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄和代謝重編程，使其成為終衰竭的T細(xì)胞。我們的發(fā)現(xiàn)也具有臨床意義，因為嵌合抗原受體(CAR) T細(xì)胞的代謝工程是一種很有前途的策略，可以增強腫瘤免疫治療中Tpex細(xì)胞的干性和功能。 結(jié)果： （1）終端T細(xì)胞耗竭以代謝重編程為特征 為了分析枯竭T細(xì)胞沿發(fā)育軌跡的轉(zhuǎn)錄代謝程序，我們對感染淋巴細(xì)胞性脈絡(luò)叢腦膜炎病毒(LCMVCL13)克隆13株后從慢性感染野生型(WT)小鼠中分離的CD44+ PD-1hi CD8+ T細(xì)胞進行了單細(xì)胞(sc) RNA測序(補充圖1a)。為了避免由于活躍細(xì)胞分裂造成的偏差，我們專注于非增殖T細(xì)胞，并使用均勻流形近似和投影(UMAP)可視化的無監(jiān)督聚類識別出六個主要的耗盡T細(xì)胞群體(圖1a和補充圖1b)。Tpex細(xì)胞的特征是活化(Cd44, Cd69, Icos)，耗竭(Pdcd1, Tox)和記憶相關(guān)分子(Sell, Ccr7, Tcf7, Slamf6, Id3, Cxcr5)的獨特組合(圖1b-d和補充圖1b, c)。擴散偽時間分析預(yù)測了源于“莖樣”CD62L+ Tpex1細(xì)胞的兩條分化軌跡(圖1b)。其中一條軌跡合并為“類似ctl”的耗盡T細(xì)胞群，其特征是表達(dá)Cx3cr1、Klrg1和S100a4(補充圖1c)26。第二個譜系指向最終耗盡的T細(xì)胞(圖1b)。事實上，Tex1和Tex2亞群顯示出終端衰竭標(biāo)記的漸進式上調(diào)，如Havcr2(編碼Tim-3)、Cxcr6、Id2、Lag3、Gzma、Cd244a (2B4)和Tnfrsf9 (4-1BB)(圖1c、d和補充圖1c)。這兩個譜系的分叉發(fā)生在小而不同的Ttransit集群中，該集群的標(biāo)志是tpx相關(guān)基因的下調(diào)，包括Sell (CD62L)、Ccr7、Tcf7、Il7r、Id3和Slamf6 (Ly108)，以及末端耗盡標(biāo)記物的中間表達(dá)(圖1d)。為了進一步探索干細(xì)胞樣CD62L+ Tpex細(xì)胞向ctl樣和終末耗散T細(xì)胞分化過程中的代謝轉(zhuǎn)錄程序，我們計算了糖酵解、線粒體呼吸、脂質(zhì)代謝和戊糖磷酸途徑等代謝途徑的基因集富集分?jǐn)?shù)(Supplementary Table S1)。這些分析顯示，在Tpex向終末分化T細(xì)胞過渡時，線粒體(基因集ID M9577)和呼吸鏈基因(M19046)表達(dá)急劇下降(圖1e)，表明線粒體(dys-)功能與T細(xì)胞衰竭之間存在關(guān)系。與我們的scRNA測序數(shù)據(jù)并行，我們分析了來自慢性感染小鼠的ID3+ Tpex和Tim-3+ Tex細(xì)胞的公開大量RNA測序數(shù)據(jù)4(補充圖1d, e)。基因集富集分析(GSEA)和基因網(wǎng)絡(luò)聚類揭示了線粒體代謝和翻譯途徑與Tpex細(xì)胞的顯著相關(guān)性，而Tex細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組主要與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)。細(xì)胞周期和DNA修復(fù)基因表達(dá)特征。GSEA利用基因本體(GO)途徑，如線粒體基因(M9577)、線粒體翻譯(M27446)以及通過化學(xué)滲透偶聯(lián)(M1025)進行呼吸電子傳遞和ATP合成，進一步支持了Tpex細(xì)胞比Tex細(xì)胞更依賴線粒體呼吸的觀點。 為了直接測量耗盡T細(xì)胞的線粒體呼吸，我們用LCMVCL13感染W(wǎng)T小鼠，并通過FACS分選分離Ly108+ Tpex和Tim-3+ Tex細(xì)胞(圖1f)。與轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)一致，細(xì)胞外通量分析顯示，與Tex細(xì)胞相比，Tpex的基礎(chǔ)和最大耗氧率(OCR)更高(圖1g)，表明Tpex細(xì)胞更依賴于OXPHOS。以最大OCR和基礎(chǔ)OCR之差計算的備用呼吸能力(SRC)表明，Tpex細(xì)胞具有更大的代謝儲備來利用線粒體呼吸，而Tex細(xì)胞幾乎以最大容量操作OXPHOS(圖1g)。SRC的差異可以通過線粒體含量的改變和/或線粒體再生能力的差異來解釋。為了測試這些可能性，我們使用mitto -Dendra2小鼠27，它們表達(dá)線粒體定位版本的Dendra2蛋白。利用與線粒體質(zhì)量/體積相關(guān)的mito-Dendra2的綠色熒光27，我們可以很容易地檢測到Tpex細(xì)胞的線粒體含量明顯高于Tex細(xì)胞。為了描述耗盡T細(xì)胞的線粒體更新和再生能力，我們用細(xì)胞微量紫(CTV)標(biāo)記慢性感染mito-Dendra2小鼠的T細(xì)胞，并在405 nm激光照射下不可逆地將線粒體熒光發(fā)射光譜從綠色熒光切換為紅色熒光.我們在體外追蹤了未分裂的Tpex和Tex細(xì)胞中非紅色線粒體的出現(xiàn)，作為線粒體再生的一種措施。Mitotracker和TMRE探針證實，與Tpex細(xì)胞相比，Tex細(xì)胞的線粒體含量和膜電位更低。此外，Tex細(xì)胞顯示電子傳遞鏈(ETC)復(fù)合物和線粒體生物發(fā)生因子，如PGC-1α和TFAM 的表達(dá)減少。 與其線粒體功能受損相比，與Tpex細(xì)胞相比，Tex細(xì)胞表現(xiàn)出糖酵解質(zhì)子外排率(glycoPER)升高(圖1j)，這表明Tex細(xì)胞通過有氧糖酵解升高來補償線粒體功能不足。Tex細(xì)胞細(xì)胞外酸化率(ECAR)的增加與營養(yǎng)轉(zhuǎn)運蛋白和糖酵解酶如Slc2a3(編碼GLUT328)、Aldoa和Gapdh的表達(dá)增加相關(guān)(圖1k)。與前體細(xì)胞相比，特克斯細(xì)胞的ECAR:OCR比值更高，這進一步支持了T細(xì)胞衰竭是由線粒體呼吸到有氧糖酵解的代謝轉(zhuǎn)換介導(dǎo)的這一觀點(圖11)。當(dāng)我們計算糖酵解和線粒體代謝對ATP產(chǎn)生的貢獻時，我們發(fā)現(xiàn)Tpex細(xì)胞主要依賴于OXPHOS，而Tex細(xì)胞對有氧糖酵解的依賴性要高2.5倍(圖1m)�？偟膩碚f，這些數(shù)據(jù)表明線粒體呼吸減少和類似Warburg效應(yīng)的糖酵解重編程是晚期T細(xì)胞衰竭的代謝標(biāo)志。 （2）線粒體呼吸控制T細(xì)胞的功能性衰竭 已經(jīng)確定線粒體ATP生成受損與Tpex向Tex細(xì)胞的轉(zhuǎn)變是一致的，我們開始描述這些代謝變化是T細(xì)胞衰竭的結(jié)果還是原因。 （3）氧化應(yīng)激穩(wěn)定Tpex細(xì)胞中的HIF-1α蛋白水平 為了了解mpc缺陷T細(xì)胞的代謝變化如何控制T細(xì)胞衰竭過程中的復(fù)雜轉(zhuǎn)錄過程，我們使用液相色譜和質(zhì)譜(LC/MS)分析了它們的代謝組(圖4a)。mpc缺陷T細(xì)胞中下調(diào)最多的代謝物是幾種糖酵解中間體，如果糖-6-磷酸、果糖-1,6-二磷酸、二羥丙酮磷酸(DHAP)、甘油醛-3-磷酸(G3P)和磷酸烯醇丙酮酸(PEP)，這可能是由于糖酵解通量加速所致。此外，在mpc缺失的T細(xì)胞中，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)的還原形式下調(diào)(圖4a)，導(dǎo)致NADPH/NADP+平衡移位(圖4b)。 總的來說，這些數(shù)據(jù)表明氧化應(yīng)激和線粒體功能不足引起的代謝重編程支持HIF-1α蛋白穩(wěn)定和T細(xì)胞衰竭。 （4）hif -1α介導(dǎo)的糖酵解重編程支持終端T細(xì)胞分化 接下來，我們研究了HIF-1α消融如何影響慢性病毒感染期間的終端t細(xì)胞衰竭�？傊@些發(fā)現(xiàn)表明，線粒體功能不全和hif -1α介導(dǎo)的糖酵解重編程都會導(dǎo)致T細(xì)胞衰竭，而糖酵解重編程的藥理抑制是一種可行的代謝干預(yù)策略，可以在慢性病毒感染和癌癥免疫治療期間維持(CAR) T細(xì)胞的干性、壽命和功能。 |
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