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[交流] 線粒體功能障礙通過HIF-1α介導的糖酵解重編程促進前體細胞向終末衰竭 T 細胞過渡

急性感染后，CD8+ T細胞增殖并分化為細胞毒性T淋巴細胞(ctl)以消除感染的靶細胞。ctl的分化與轉錄、表觀遺傳和代謝重組相平行，以支持其克隆擴增和效應功能，如細胞因子分泌和細胞毒性。在病原體被清除和炎癥消退后，大多數(shù)效應T細胞死亡，只有少數(shù)淋巴細胞作為長期記憶T細胞保留下來。
然而，當抗原不能被消除時，例如在持續(xù)性感染和癌癥中，持續(xù)的抗原受體刺激會驅動另一種分化軌跡，即T細胞耗竭。耗竭的T (Tex)細胞在表型上表現(xiàn)為PD-1、Tim-3和Lag-3等共抑制受體的上調，在功能上表現(xiàn)為細胞因子分泌和細胞溶解活性的下降。盡管在終末分化過程中，特克斯細胞會失去增殖能力并發(fā)生凋亡，但它們會被一個獨特的多能細胞群體穩(wěn)定地補充，這些細胞被稱為耗盡的T (Tpex)細胞的前體細胞(或祖細胞)。Tpex細胞可以通過表達記憶相關分子，如轉錄因子TCF-1和細胞表面分子Ly108和CD62L來識別，但沒有終端分化標記，如Tim-3和CD160。Tpex細胞的“干樣”自我更新能力及其在慢性感染小鼠的過繼轉移后優(yōu)越的再生潛力激發(fā)了越來越多的科學興趣，以確定控制從多能Tpex向功能失調的Tex細胞轉變的分子機制。這個問題也與臨床相關，因為Tpex細胞是治療性檢查點阻斷后抗腫瘤免疫反應的主要介質。雖然PD-1在Tpex和終末耗竭的T細胞上都有表達，但只有Tpex細胞對抗PD-1治療有有效的反應，表現(xiàn)為增殖爆發(fā)和分化為細胞毒性T細胞，從而在接受檢查點免疫治療的患者中重新激活抗腫瘤免疫反應。然而，維持Tpex細胞干性的分子機制和指示其功能衰竭的信號仍不完全清楚，值得進一步研究以改善癌癥免疫治療的臨床結果。

研究概要：
T細胞衰竭是癌癥和持續(xù)性感染的標志，其特征是抑制性受體上調、細胞因子分泌減少和細胞溶解活性受損。最終耗竭的T細胞由前體細胞群(Tpex)穩(wěn)定地補充，但是控制Tpex維持的代謝原理和控制其耗竭的調節(jié)回路仍然不完全清楚。通過結合基因缺陷小鼠、單細胞轉錄組學和代謝組學分析，我們發(fā)現(xiàn)線粒體功能不足是啟動T細胞功能衰竭的細胞內在觸發(fā)因素。在分子水平上，我們發(fā)現(xiàn)線粒體功能障礙引起氧化還原應激，從而抑制缺氧誘導因子1α (HIF-1α)的蛋白酶體降解，并促進Tpex細胞的轉錄和代謝重編程，使其成為終衰竭的T細胞。我們的發(fā)現(xiàn)也具有臨床意義，因為嵌合抗原受體(CAR) T細胞的代謝工程是一種很有前途的策略，可以增強腫瘤免疫治療中Tpex細胞的干性和功能。
結果：
（1）終端T細胞耗竭以代謝重編程為特征
為了分析枯竭T細胞沿發(fā)育軌跡的轉錄代謝程序，我們對感染淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病毒(LCMVCL13)克隆13株后從慢性感染野生型(WT)小鼠中分離的CD44+ PD-1hi CD8+ T細胞進行了單細胞(sc) RNA測序(補充圖1a)。為了避免由于活躍細胞分裂造成的偏差，我們專注于非增殖T細胞，并使用均勻流形近似和投影(UMAP)可視化的無監(jiān)督聚類識別出六個主要的耗盡T細胞群體(圖1a和補充圖1b)。Tpex細胞的特征是活化(Cd44, Cd69, Icos)，耗竭(Pdcd1, Tox)和記憶相關分子(Sell, Ccr7, Tcf7, Slamf6, Id3, Cxcr5)的獨特組合(圖1b-d和補充圖1b, c)。擴散偽時間分析預測了源于“莖樣”CD62L+ Tpex1細胞的兩條分化軌跡(圖1b)。其中一條軌跡合并為“類似ctl”的耗盡T細胞群，其特征是表達Cx3cr1、Klrg1和S100a4(補充圖1c)26。第二個譜系指向最終耗盡的T細胞(圖1b)。事實上，Tex1和Tex2亞群顯示出終端衰竭標記的漸進式上調，如Havcr2(編碼Tim-3)、Cxcr6、Id2、Lag3、Gzma、Cd244a (2B4)和Tnfrsf9 (4-1BB)(圖1c、d和補充圖1c)。這兩個譜系的分叉發(fā)生在小而不同的Ttransit集群中，該集群的標志是tpx相關基因的下調，包括Sell (CD62L)、Ccr7、Tcf7、Il7r、Id3和Slamf6 (Ly108)，以及末端耗盡標記物的中間表達(圖1d)。為了進一步探索干細胞樣CD62L+ Tpex細胞向ctl樣和終末耗散T細胞分化過程中的代謝轉錄程序，我們計算了糖酵解、線粒體呼吸、脂質代謝和戊糖磷酸途徑等代謝途徑的基因集富集分數(shù)(Supplementary Table S1)。這些分析顯示，在Tpex向終末分化T細胞過渡時，線粒體(基因集ID M9577)和呼吸鏈基因(M19046)表達急劇下降(圖1e)，表明線粒體(dys-)功能與T細胞衰竭之間存在關系。與我們的scRNA測序數(shù)據(jù)并行，我們分析了來自慢性感染小鼠的ID3+ Tpex和Tim-3+ Tex細胞的公開大量RNA測序數(shù)據(jù)4(補充圖1d, e)�；蚣患治�(GSEA)和基因網絡聚類揭示了線粒體代謝和翻譯途徑與Tpex細胞的顯著相關性，而Tex細胞的轉錄組主要與信號轉導相關。細胞周期和DNA修復基因表達特征。GSEA利用基因本體(GO)途徑，如線粒體基因(M9577)、線粒體翻譯(M27446)以及通過化學滲透偶聯(lián)(M1025)進行呼吸電子傳遞和ATP合成，進一步支持了Tpex細胞比Tex細胞更依賴線粒體呼吸的觀點。

為了直接測量耗盡T細胞的線粒體呼吸，我們用LCMVCL13感染WT小鼠，并通過FACS分選分離Ly108+ Tpex和Tim-3+ Tex細胞(圖1f)。與轉錄組學數(shù)據(jù)一致，細胞外通量分析顯示，與Tex細胞相比，Tpex的基礎和最大耗氧率(OCR)更高(圖1g)，表明Tpex細胞更依賴于OXPHOS。以最大OCR和基礎OCR之差計算的備用呼吸能力(SRC)表明，Tpex細胞具有更大的代謝儲備來利用線粒體呼吸，而Tex細胞幾乎以最大容量操作OXPHOS(圖1g)。SRC的差異可以通過線粒體含量的改變和/或線粒體再生能力的差異來解釋。為了測試這些可能性，我們使用mitto -Dendra2小鼠27，它們表達線粒體定位版本的Dendra2蛋白。利用與線粒體質量/體積相關的mito-Dendra2的綠色熒光27，我們可以很容易地檢測到Tpex細胞的線粒體含量明顯高于Tex細胞。為了描述耗盡T細胞的線粒體更新和再生能力，我們用細胞微量紫(CTV)標記慢性感染mito-Dendra2小鼠的T細胞，并在405 nm激光照射下不可逆地將線粒體熒光發(fā)射光譜從綠色熒光切換為紅色熒光.我們在體外追蹤了未分裂的Tpex和Tex細胞中非紅色線粒體的出現(xiàn)，作為線粒體再生的一種措施。Mitotracker和TMRE探針證實，與Tpex細胞相比，Tex細胞的線粒體含量和膜電位更低。此外，Tex細胞顯示電子傳遞鏈(ETC)復合物和線粒體生物發(fā)生因子，如PGC-1α和TFAM 的表達減少。

與其線粒體功能受損相比，與Tpex細胞相比，Tex細胞表現(xiàn)出糖酵解質子外排率(glycoPER)升高(圖1j)，這表明Tex細胞通過有氧糖酵解升高來補償線粒體功能不足。Tex細胞細胞外酸化率(ECAR)的增加與營養(yǎng)轉運蛋白和糖酵解酶如Slc2a3(編碼GLUT328)、Aldoa和Gapdh的表達增加相關(圖1k)。與前體細胞相比，特克斯細胞的ECAR:OCR比值更高，這進一步支持了T細胞衰竭是由線粒體呼吸到有氧糖酵解的代謝轉換介導的這一觀點(圖11)。當我們計算糖酵解和線粒體代謝對ATP產生的貢獻時，我們發(fā)現(xiàn)Tpex細胞主要依賴于OXPHOS，而Tex細胞對有氧糖酵解的依賴性要高2.5倍(圖1m)�？偟膩碚f，這些數(shù)據(jù)表明線粒體呼吸減少和類似Warburg效應的糖酵解重編程是晚期T細胞衰竭的代謝標志。
（2）線粒體呼吸控制T細胞的功能性衰竭
已經確定線粒體ATP生成受損與Tpex向Tex細胞的轉變是一致的，我們開始描述這些代謝變化是T細胞衰竭的結果還是原因。

（3）氧化應激穩(wěn)定Tpex細胞中的HIF-1α蛋白水平
為了了解mpc缺陷T細胞的代謝變化如何控制T細胞衰竭過程中的復雜轉錄過程，我們使用液相色譜和質譜(LC/MS)分析了它們的代謝組(圖4a)。mpc缺陷T細胞中下調最多的代謝物是幾種糖酵解中間體，如果糖-6-磷酸、果糖-1,6-二磷酸、二羥丙酮磷酸(DHAP)、甘油醛-3-磷酸(G3P)和磷酸烯醇丙酮酸(PEP)，這可能是由于糖酵解通量加速所致。此外，在mpc缺失的T細胞中，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)的還原形式下調(圖4a)，導致NADPH/NADP+平衡移位(圖4b)。
總的來說，這些數(shù)據(jù)表明氧化應激和線粒體功能不足引起的代謝重編程支持HIF-1α蛋白穩(wěn)定和T細胞衰竭。

（4）hif -1α介導的糖酵解重編程支持終端T細胞分化
接下來，我們研究了HIF-1α消融如何影響慢性病毒感染期間的終端t細胞衰竭�？傊@些發(fā)現(xiàn)表明，線粒體功能不全和hif -1α介導的糖酵解重編程都會導致T細胞衰竭，而糖酵解重編程的藥理抑制是一種可行的代謝干預策略，可以在慢性病毒感染和癌癥免疫治療期間維持(CAR) T細胞的干性、壽命和功能。

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