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yanxiangru金蟲(chóng) (小有名氣)
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[交流]
如何讓檢測(cè)菌體的DNA或ATP含量 已有2人參與
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| 我想要1篇測(cè)量菌體DNA或ATP含量的詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)方法！希望各位大俠幫幫忙，有的可以發(fā)到我的郵箱，happyme198603@163.com |
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銀蟲(chóng) (小有名氣)
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yanxiangru(金幣+2,VIP+0): 雖然不是我想要的，但寫(xiě)這么多也有獎(jiǎng)勵(lì) 11-20 09:02
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電泳法測(cè)定ATP含量及影響因素的討論 三磷酸腺苷二鈉（ATP）為腺嘌呤核苷-5′-三磷酸酯二鈉鹽，由發(fā)酵法制得。由于ATP在生產(chǎn)中易帶入ADP等雜質(zhì)，在貯存中易分解成ADP等。ATP、ADP、AMP在紫外均有吸收，必須用紙層析或紙電泳先行分離洗脫后，再用紫外法測(cè)其吸收度，計(jì)算含量。若分離不好，實(shí)驗(yàn)因素控制不當(dāng)，則影響其含量的測(cè)定。 ATP的含量測(cè)定，衛(wèi)生部標(biāo)準(zhǔn)及地方標(biāo)準(zhǔn)的測(cè)定方法均采用紙電泳法分離，紫外分光法測(cè)定其吸收度，計(jì)算含量。但具體測(cè)定過(guò)程各地方標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定條件有所不同，或與藥典規(guī)定存在差異。雖有規(guī)定測(cè)定方法以最新版藥典為依據(jù)，但如ATP片仍按各地方標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)，還未上衛(wèi)生部標(biāo)準(zhǔn)，在檢驗(yàn)過(guò)程存在無(wú)所適從的情況，可能由于電泳法測(cè)定ATP含量過(guò)程影響因素較多之故。因此，基于共同探討解決這個(gè)問(wèn)題，通過(guò)日常工作中的經(jīng)驗(yàn)積累總結(jié)，對(duì)ATP的含量測(cè)定過(guò)程作初步的總結(jié)。 1 實(shí)驗(yàn)部分 1.1 試液、緩沖液 0.01 mol／L鹽酸液、1 mol／L甲酸液、枸櫞酸鹽緩沖液（pH 3.0）。 1.2 儀器和用具 紫外分光光度計(jì)、電吹風(fēng)、水平式電泳儀、直流電源、色譜濾紙、容量瓶（10 ml）、具塞試管（20×100 mm)、刻度吸管、移液管（5 ml）、微量注射器、3號(hào)垂熔玻璃漏斗、紫外光燈（254 nm）。 1.3 儀器裝置 參照《中國(guó)藥典》1995年二部附錄 1.4 操作法 1.4.1 試液、緩沖液 0.01 mol．L-1鹽酸液量取鹽酸0.9 ml，加水至1000 ml混勻。1 mol．L-1甲酸液取甲酸［98％（w／w 75.5 ml］，加水稀釋至2000 ml。枸櫞酸鹽緩沖液（pH3.0） 取枸櫞酸（C6H8O7．H2O）39.04 g與枸櫞酸鈉（C6H5N3O7．2H2O）4.12 g(均精確至0.01 g)加水4000 ml，使溶解，用酸度計(jì)調(diào)pH值至3.0。1.4.2色譜紙 取色譜濾紙置1 mol／L甲酸溶液中浸泡過(guò)液，次日取出用水漂洗至洗液pH值不低于4，置60℃烘箱烘干，備用，長(zhǎng)度及大小根據(jù)電泳室的大小裁剪。1.4.3點(diǎn)樣有濕法點(diǎn)樣和干法點(diǎn)樣。濕法點(diǎn)樣：是將裁好的濾紙全部浸入枸櫞酸鹽緩沖液（pH3.0)中，濕潤(rùn)后，取出，用濾紙吸干多余的緩沖液，置電泳槽架上，使起始線靠近陰極端，將濾紙兩端浸入緩沖液中，然后用微量注射器精密點(diǎn)加供試品溶液：每點(diǎn)10μl，共3點(diǎn)，并留2個(gè)空白位置；干法點(diǎn)樣：是將供試品溶液點(diǎn)于濾紙上，吹干，再點(diǎn)，反復(fù)數(shù)次，直至點(diǎn)完規(guī)定量的供試品溶液，然后用噴霧器，將濾紙噴濕，點(diǎn)樣處最后噴濕(本法適用于稀的供試品溶液)。1.4.4電泳于電泳槽中加入適量電泳緩沖液，浸沒(méi)鉑電極，接通電泳儀，穩(wěn)壓電源檔，調(diào)整電壓梯度為18～20 v／cm，電泳1 h 45 min，取出立即吹干，置紫外燈（254 nm）下檢視，用鉛筆劃出紫色斑點(diǎn)的位置，跑在濾紙最前面的紫色斑點(diǎn)是ATP。1.4.5含量測(cè)定剪下供試品斑點(diǎn)和與斑點(diǎn)位置相近的空白濾紙，剪成細(xì)條，分別置試管中，各精密加入0.01 mol／L鹽酸溶液5 ml，搖勻，放置1 h，用3號(hào)垂熔玻璃漏斗，濾過(guò)，也可用自然沉降或離心法傾取上清液，按各藥項(xiàng)下的規(guī)定測(cè)定吸收度，并按吸收系數(shù)計(jì)算含量。 結(jié)果判斷，2份樣品的相對(duì)誤差應(yīng)不大于3％。 2 注意事項(xiàng) 2.1 點(diǎn)樣位置在陰極 2.2 在不帶電點(diǎn)樣情況下，樣品應(yīng)在2～3 min內(nèi)點(diǎn)完，立即開(kāi)啟電源進(jìn)行電泳，否則造成斑點(diǎn)擴(kuò)散，使測(cè)得的含量偏低。 2.3 用0.01 mol．L-1鹽酸洗脫時(shí)，室溫不宜過(guò)低，若室溫低于15℃，可置25～30℃水浴中進(jìn)行洗脫。 2.4 洗脫時(shí)，應(yīng)不斷振搖使洗脫完全，放置時(shí)間也不宜過(guò)長(zhǎng)，否則，影響含量測(cè)定的穩(wěn)定性。 2.5 微量注射器宜校正后使用。 3 討論 由于操作過(guò)程影響因素較多，以下幾點(diǎn)是作者在工作中的幾點(diǎn)感受與大家共同探討。 3.1 枸櫞酸鹽緩沖液離子強(qiáng)度和pH值的影響，M／20緩沖液（pH4.8）的分離效果（ADP泳動(dòng)距離／ATP的泳動(dòng)距離為0.89)和分離速度(電壓梯度20 v／cm時(shí)為3.7 cm／h)，不及M／20緩沖液（pH3），后者分離效果為0.69，分離速度為6.5 cm／h。M／50緩沖液（pH 3）與M／20緩沖液（pH3）比較，前者斑點(diǎn)擴(kuò)散。 3.2 層析濾紙經(jīng)甲酸處理后，可除去紙中金屬離子，使ATP、ADP、AMP的斑點(diǎn)集中，分離完全，且使濾紙的空白吸收值減小，有利于提高結(jié)果的精度。 3.3 采用濕法點(diǎn)樣與干法點(diǎn)樣，認(rèn)為濕法帶電點(diǎn)樣，其斑點(diǎn)大小與分離效果均優(yōu)于干法點(diǎn)樣，測(cè)定結(jié)果平行性好。 3.4 電泳開(kāi)始時(shí)，應(yīng)立即在色譜紙上補(bǔ)充緩沖液，可避免因色譜紙上緩沖液過(guò)少，而影響斑點(diǎn)分離。 3.5 測(cè)定波長(zhǎng)和吸收系數(shù)，按核酸類物質(zhì)測(cè)定，習(xí)慣在260 nm的波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度，而不是在吸收峰處，可能會(huì)因分光光度計(jì)波長(zhǎng)誤差引起測(cè)定結(jié)果的差異，衛(wèi)生部標(biāo)準(zhǔn)（1989年）采用的吸收峰處（257±1 nm）測(cè)定，可克服這一不足。 3.6 電壓梯度，直接根據(jù)色譜紙的實(shí)際電泳長(zhǎng)度按（18～20 v／cm）計(jì)算總電壓，較好控制。 3.7 電泳時(shí)間，不宜過(guò)長(zhǎng)，按衛(wèi)生部標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定為1 h 45 min，有的地方標(biāo)準(zhǔn)，ATP片電泳時(shí)間2.5 h，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)影響整個(gè)試驗(yàn)操作安排，而且電泳過(guò)程因電能轉(zhuǎn)化，不斷散熱，可能也會(huì)影響結(jié)果，建議采取散熱措施。 3.8 各地方標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)一情況，有的地方標(biāo)準(zhǔn)，仍與衛(wèi)生部標(biāo)準(zhǔn)，不能統(tǒng)一，電泳時(shí)，如緩沖液pH為（4.8），測(cè)定波長(zhǎng)為260 nm，E1%1 cm＝259，電泳時(shí)間為2.5 h，使得最后計(jì)算結(jié)果存在差異(與衛(wèi)生部標(biāo)準(zhǔn)方法比較)。 參考文獻(xiàn) ［1］中國(guó)藥典：二部，1995；附錄28 �。�2］中國(guó)藥品檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范/衛(wèi)生部藥政局：中國(guó)藥品生物制品檢定所編，北京，中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，1996；6：352 ［3］中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)：抗生素生化藥品注釋，中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥典委員會(huì)編，1990；69 檢測(cè)菌體DNA 微生物生長(zhǎng)的測(cè)定方法有多種，根據(jù)研究對(duì)象或目的選擇。 (一)微生物細(xì)胞數(shù)目的檢測(cè)方法 1．總細(xì)胞計(jì)數(shù)法 顯微鏡直接記數(shù)法和比濁法 (1)血球計(jì)數(shù)板法 血球汁數(shù)板中央有一個(gè)體積一定的計(jì)數(shù)室( 0.1mm3。將菌懸液或孢子懸液在顯微鏡下計(jì)數(shù)，然后再按一定公式計(jì)算出細(xì)菌總數(shù)。 (2)涂片計(jì)數(shù)法 將一定體積(0.1ml)的樣品，均勻地涂在載片的一定面積內(nèi)(1cm2。在顯微鏡下計(jì)算細(xì)胞數(shù)量，推算1cm2所含細(xì)胞數(shù)目。 （3）比濁法：菌體細(xì)胞培養(yǎng)液混濁，在一定范圍內(nèi)，菌體數(shù)量與渾濁成正比，故可通過(guò)分光光度計(jì)或比色計(jì)求出渾濁度，通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)比，求出樣品中菌液濃度，算出個(gè)體數(shù)。 特點(diǎn)：所得結(jié)果包括死菌和活菌。 2. 活菌計(jì)數(shù)法（平板菌落記數(shù)法）： 是通過(guò)測(cè)定樣品在培養(yǎng)基上形成的菌落數(shù)來(lái)間接確定其活菌數(shù)的方法．故又稱平板計(jì)數(shù)法。 特點(diǎn)：計(jì)算的結(jié)果是活菌落。 注意：樣品稀釋度。一個(gè)活細(xì)胞形成一個(gè)菌落。 （1）涂布平板法 用滅菌的涂布器將一定體積(不大于0.1ml)的適當(dāng)稀釋度的菌液涂布在瓊脂培養(yǎng)基的表面，然后保溫培養(yǎng)有到菌落出現(xiàn)，記錄菌落的數(shù)目并換算成每毫升試樣中的活細(xì)胞數(shù)量。 （2）倒平板法 將樣品稀釋到一定濃度，取一定體積(0.1—1ml)倒入冷卻至45℃的固體培養(yǎng)基混合，制成平板，培養(yǎng)后，出現(xiàn)菌落，由菌落數(shù)推算出的菌總數(shù)。 3 濾膜過(guò)濾法：樣品同過(guò)微孔濾膜后，細(xì)菌收集在濾膜上，然后將濾膜放在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，通過(guò)菌落計(jì)數(shù)求出樣品活菌落。 (二)微生物生長(zhǎng)量和生理指標(biāo)的測(cè)定方法 測(cè)定微生物生長(zhǎng)量及相關(guān)的生理指標(biāo)，常用以下方法： 1．濕重法：將單位體積微生物培養(yǎng)液離心，收集沉淀物，然后再稱重。 2．干重法：將離心得到的細(xì)胞沉淀物，置于100---105℃的烘箱中干燥過(guò)夜除去水分，然后再稱重。 特點(diǎn)：適合與菌體濃度高的樣品。表示菌體生長(zhǎng)量。 3、測(cè)定細(xì)胞內(nèi)菌種化學(xué)成分：方法難，操做困難，但較準(zhǔn)確。 細(xì)胞內(nèi)菌種化學(xué)成分多少（∝），反映群體中菌體數(shù)量的多少。 （1） 測(cè)定含氮量：N在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定，測(cè)定總N量，粗蛋白=N*6.25g。 （2） 測(cè)定DNA：微生物細(xì)胞DNA含量穩(wěn)定，采用熒光指示劑或染色劑與菌體DNA作用熒光比色或分光光度法測(cè)得DNA的含量。 （3） 其他生理指標(biāo)：如測(cè)定碳、磷、RNA、ATP、DAP(二氨基庚二酸)的含量等。 (二)絲狀微生物菌絲長(zhǎng)度的測(cè)定方法 對(duì)于絲狀微生物。特別是絲狀真菌，通常是通過(guò)測(cè)定菌絲的長(zhǎng)度變化來(lái)反映它們的生長(zhǎng)速率。方法有： 1．培養(yǎng)基表面菌體生長(zhǎng)速率測(cè)定法 主要測(cè)定一定時(shí)間內(nèi)在瓊脂培養(yǎng)基表面的菌落直徑的增加值。 2．培養(yǎng)料中菌體速率測(cè)定法 主要測(cè)定一定時(shí)間內(nèi)在固體培養(yǎng)料中菌絲體向前延伸的距離。 如：栽培食用菌的培養(yǎng)料。 3．單個(gè)菌絲頂端生長(zhǎng)速率測(cè)定法 在顯微鏡下借助目鏡測(cè)微尺測(cè)定在一定時(shí)間內(nèi)單個(gè)菌絲的伸長(zhǎng)長(zhǎng)度。 |
2樓2009-11-19 20:44:07
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4樓2010-07-04 23:19:43
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