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yanxiangru金蟲 (小有名氣)
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[交流]
如何讓檢測菌體的DNA或ATP含量 已有2人參與
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| 我想要1篇測量菌體DNA或ATP含量的詳細的實驗方法！希望各位大俠幫幫忙，有的可以發(fā)到我的郵箱，happyme198603@163.com |
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銀蟲 (小有名氣)
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yanxiangru(金幣+2,VIP+0): 雖然不是我想要的，但寫這么多也有獎勵 11-20 09:02
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電泳法測定ATP含量及影響因素的討論 三磷酸腺苷二鈉（ATP）為腺嘌呤核苷-5′-三磷酸酯二鈉鹽，由發(fā)酵法制得。由于ATP在生產(chǎn)中易帶入ADP等雜質，在貯存中易分解成ADP等。ATP、ADP、AMP在紫外均有吸收，必須用紙層析或紙電泳先行分離洗脫后，再用紫外法測其吸收度，計算含量。若分離不好，實驗因素控制不當，則影響其含量的測定。 ATP的含量測定，衛(wèi)生部標準及地方標準的測定方法均采用紙電泳法分離，紫外分光法測定其吸收度，計算含量。但具體測定過程各地方標準測定條件有所不同，或與藥典規(guī)定存在差異。雖有規(guī)定測定方法以最新版藥典為依據(jù)，但如ATP片仍按各地方標準檢驗，還未上衛(wèi)生部標準，在檢驗過程存在無所適從的情況，可能由于電泳法測定ATP含量過程影響因素較多之故。因此，基于共同探討解決這個問題，通過日常工作中的經(jīng)驗積累總結，對ATP的含量測定過程作初步的總結。 1 實驗部分 1.1 試液、緩沖液 0.01 mol／L鹽酸液、1 mol／L甲酸液、枸櫞酸鹽緩沖液（pH 3.0）。 1.2 儀器和用具 紫外分光光度計、電吹風、水平式電泳儀、直流電源、色譜濾紙、容量瓶（10 ml）、具塞試管（20×100 mm)、刻度吸管、移液管（5 ml）、微量注射器、3號垂熔玻璃漏斗、紫外光燈（254 nm）。 1.3 儀器裝置 參照《中國藥典》1995年二部附錄 1.4 操作法 1.4.1 試液、緩沖液 0.01 mol．L-1鹽酸液量取鹽酸0.9 ml，加水至1000 ml混勻。1 mol．L-1甲酸液取甲酸［98％（w／w 75.5 ml］，加水稀釋至2000 ml。枸櫞酸鹽緩沖液（pH3.0） 取枸櫞酸（C6H8O7．H2O）39.04 g與枸櫞酸鈉（C6H5N3O7．2H2O）4.12 g(均精確至0.01 g)加水4000 ml，使溶解，用酸度計調pH值至3.0。1.4.2色譜紙 取色譜濾紙置1 mol／L甲酸溶液中浸泡過液，次日取出用水漂洗至洗液pH值不低于4，置60℃烘箱烘干，備用，長度及大小根據(jù)電泳室的大小裁剪。1.4.3點樣有濕法點樣和干法點樣。濕法點樣：是將裁好的濾紙全部浸入枸櫞酸鹽緩沖液（pH3.0)中，濕潤后，取出，用濾紙吸干多余的緩沖液，置電泳槽架上，使起始線靠近陰極端，將濾紙兩端浸入緩沖液中，然后用微量注射器精密點加供試品溶液：每點10μl，共3點，并留2個空白位置；干法點樣：是將供試品溶液點于濾紙上，吹干，再點，反復數(shù)次，直至點完規(guī)定量的供試品溶液，然后用噴霧器，將濾紙噴濕，點樣處最后噴濕(本法適用于稀的供試品溶液)。1.4.4電泳于電泳槽中加入適量電泳緩沖液，浸沒鉑電極，接通電泳儀，穩(wěn)壓電源檔，調整電壓梯度為18～20 v／cm，電泳1 h 45 min，取出立即吹干，置紫外燈（254 nm）下檢視，用鉛筆劃出紫色斑點的位置，跑在濾紙最前面的紫色斑點是ATP。1.4.5含量測定剪下供試品斑點和與斑點位置相近的空白濾紙，剪成細條，分別置試管中，各精密加入0.01 mol／L鹽酸溶液5 ml，搖勻，放置1 h，用3號垂熔玻璃漏斗，濾過，也可用自然沉降或離心法傾取上清液，按各藥項下的規(guī)定測定吸收度，并按吸收系數(shù)計算含量。 結果判斷，2份樣品的相對誤差應不大于3％。 2 注意事項 2.1 點樣位置在陰極 2.2 在不帶電點樣情況下，樣品應在2～3 min內(nèi)點完，立即開啟電源進行電泳，否則造成斑點擴散，使測得的含量偏低。 2.3 用0.01 mol．L-1鹽酸洗脫時，室溫不宜過低，若室溫低于15℃，可置25～30℃水浴中進行洗脫。 2.4 洗脫時，應不斷振搖使洗脫完全，放置時間也不宜過長，否則，影響含量測定的穩(wěn)定性。 2.5 微量注射器宜校正后使用。 3 討論 由于操作過程影響因素較多，以下幾點是作者在工作中的幾點感受與大家共同探討。 3.1 枸櫞酸鹽緩沖液離子強度和pH值的影響，M／20緩沖液（pH4.8）的分離效果（ADP泳動距離／ATP的泳動距離為0.89)和分離速度(電壓梯度20 v／cm時為3.7 cm／h)，不及M／20緩沖液（pH3），后者分離效果為0.69，分離速度為6.5 cm／h。M／50緩沖液（pH 3）與M／20緩沖液（pH3）比較，前者斑點擴散。 3.2 層析濾紙經(jīng)甲酸處理后，可除去紙中金屬離子，使ATP、ADP、AMP的斑點集中，分離完全，且使濾紙的空白吸收值減小，有利于提高結果的精度。 3.3 采用濕法點樣與干法點樣，認為濕法帶電點樣，其斑點大小與分離效果均優(yōu)于干法點樣，測定結果平行性好。 3.4 電泳開始時，應立即在色譜紙上補充緩沖液，可避免因色譜紙上緩沖液過少，而影響斑點分離。 3.5 測定波長和吸收系數(shù)，按核酸類物質測定，習慣在260 nm的波長處測定吸收度，而不是在吸收峰處，可能會因分光光度計波長誤差引起測定結果的差異，衛(wèi)生部標準（1989年）采用的吸收峰處（257±1 nm）測定，可克服這一不足。 3.6 電壓梯度，直接根據(jù)色譜紙的實際電泳長度按（18～20 v／cm）計算總電壓，較好控制。 3.7 電泳時間，不宜過長，按衛(wèi)生部標準規(guī)定為1 h 45 min，有的地方標準，ATP片電泳時間2.5 h，時間過長影響整個試驗操作安排，而且電泳過程因電能轉化，不斷散熱，可能也會影響結果，建議采取散熱措施。 3.8 各地方標準統(tǒng)一情況，有的地方標準，仍與衛(wèi)生部標準，不能統(tǒng)一，電泳時，如緩沖液pH為（4.8），測定波長為260 nm，E1%1 cm＝259，電泳時間為2.5 h，使得最后計算結果存在差異(與衛(wèi)生部標準方法比較)。 參考文獻 �。�1］中國藥典：二部，1995；附錄28 ［2］中國藥品檢驗標準操作規(guī)范/衛(wèi)生部藥政局：中國藥品生物制品檢定所編，北京，中國醫(yī)藥科技出版社，1996；6：352 �。�3］中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標準：抗生素生化藥品注釋，中華人民共和國衛(wèi)生部藥典委員會編，1990；69 檢測菌體DNA 微生物生長的測定方法有多種，根據(jù)研究對象或目的選擇。 (一)微生物細胞數(shù)目的檢測方法 1．總細胞計數(shù)法 顯微鏡直接記數(shù)法和比濁法 (1)血球計數(shù)板法 血球汁數(shù)板中央有一個體積一定的計數(shù)室( 0.1mm3。將菌懸液或孢子懸液在顯微鏡下計數(shù)，然后再按一定公式計算出細菌總數(shù)。 (2)涂片計數(shù)法 將一定體積(0.1ml)的樣品，均勻地涂在載片的一定面積內(nèi)(1cm2。在顯微鏡下計算細胞數(shù)量，推算1cm2所含細胞數(shù)目。 （3）比濁法：菌體細胞培養(yǎng)液混濁，在一定范圍內(nèi)，菌體數(shù)量與渾濁成正比，故可通過分光光度計或比色計求出渾濁度，通過與標準曲線對比，求出樣品中菌液濃度，算出個體數(shù)。 特點：所得結果包括死菌和活菌。 2. 活菌計數(shù)法（平板菌落記數(shù)法）： 是通過測定樣品在培養(yǎng)基上形成的菌落數(shù)來間接確定其活菌數(shù)的方法．故又稱平板計數(shù)法。 特點：計算的結果是活菌落。 注意：樣品稀釋度。一個活細胞形成一個菌落。 （1）涂布平板法 用滅菌的涂布器將一定體積(不大于0.1ml)的適當稀釋度的菌液涂布在瓊脂培養(yǎng)基的表面，然后保溫培養(yǎng)有到菌落出現(xiàn)，記錄菌落的數(shù)目并換算成每毫升試樣中的活細胞數(shù)量。 （2）倒平板法 將樣品稀釋到一定濃度，取一定體積(0.1—1ml)倒入冷卻至45℃的固體培養(yǎng)基混合，制成平板，培養(yǎng)后，出現(xiàn)菌落，由菌落數(shù)推算出的菌總數(shù)。 3 濾膜過濾法：樣品同過微孔濾膜后，細菌收集在濾膜上，然后將濾膜放在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，通過菌落計數(shù)求出樣品活菌落。 (二)微生物生長量和生理指標的測定方法 測定微生物生長量及相關的生理指標，常用以下方法： 1．濕重法：將單位體積微生物培養(yǎng)液離心，收集沉淀物，然后再稱重。 2．干重法：將離心得到的細胞沉淀物，置于100---105℃的烘箱中干燥過夜除去水分，然后再稱重。 特點：適合與菌體濃度高的樣品。表示菌體生長量。 3、測定細胞內(nèi)菌種化學成分：方法難，操做困難，但較準確。 細胞內(nèi)菌種化學成分多少（∝），反映群體中菌體數(shù)量的多少。 （1） 測定含氮量：N在細胞內(nèi)穩(wěn)定，測定總N量，粗蛋白=N*6.25g。 （2） 測定DNA：微生物細胞DNA含量穩(wěn)定，采用熒光指示劑或染色劑與菌體DNA作用熒光比色或分光光度法測得DNA的含量。 （3） 其他生理指標：如測定碳、磷、RNA、ATP、DAP(二氨基庚二酸)的含量等。 (二)絲狀微生物菌絲長度的測定方法 對于絲狀微生物。特別是絲狀真菌，通常是通過測定菌絲的長度變化來反映它們的生長速率。方法有： 1．培養(yǎng)基表面菌體生長速率測定法 主要測定一定時間內(nèi)在瓊脂培養(yǎng)基表面的菌落直徑的增加值。 2．培養(yǎng)料中菌體速率測定法 主要測定一定時間內(nèi)在固體培養(yǎng)料中菌絲體向前延伸的距離。 如：栽培食用菌的培養(yǎng)料。 3．單個菌絲頂端生長速率測定法 在顯微鏡下借助目鏡測微尺測定在一定時間內(nèi)單個菌絲的伸長長度。 |
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