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1121prettycat木蟲 (正式寫手)
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[交流]
【求助/交流】關(guān)于MTT法吸光度值偏小 已有4人參與
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目前正在用MTT法測定細(xì)胞存活率，步驟是將培養(yǎng)液吸出后，加入200微升MTT，37°孵育3到4個小時，然后加入150微升DMSO，想問一下大家用的檢測波長和參考波長都是多少，我目前用的是490nm的檢測波長和650nm的測定波長，現(xiàn)在用490nm得到的吸光度值包括對照都不到0.2，大約在0.17左右，650nm檢測得到的數(shù)據(jù)大約都在0.05或者0.06，不知道吸光度值偏小是因為孵育時間不夠還是與細(xì)胞有關(guān)，因為使用別的細(xì)胞的時候吸光度值都沒有這么小，想問一下吸光度這么小數(shù)據(jù)能否使用？ 還有數(shù)據(jù)處理的時候是不是應(yīng)該用各孔在490nm檢測時得到的數(shù)值-650nm檢測時得到的數(shù)值？ |
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1121prettycat(金幣+1,VIP+0): 1-13 08:58
1121prettycat(金幣+1,VIP+0): 1-13 08:58
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這個怎么說呢，就像核酸測濃度時用260nm，蛋白測濃度用280nm一樣，是因為不同的東西有其相對應(yīng)的吸光值。MTT染色測定需要用490nm，這應(yīng)該也是理論中的事。 另外，5mg/L的MTT，每孔200微升，是不是有點(diǎn)少了，你應(yīng)該接種的是96孔板，7.5萬個細(xì)胞的接種量還可以，但是5mg/ml的濃度，是你配的5mg/L的1000倍，前者加20ul的話，你的應(yīng)該加20ml才對，也就是說你的量不夠。可以再做一次試試。 還有MTT有效期是一周，需要避光保存的。所以要注意。不過我用過避光放置一個月的（-20°C），也可以用，呵呵 祝好運(yùn) |
7樓2010-01-10 11:05:44
nicknelson
至尊木蟲 (職業(yè)作家)
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2樓2010-01-08 11:28:32
★ ★ ★ ★
1121prettycat(金幣+1):謝謝參與
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1121prettycat(金幣+1):謝謝參與
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請問你用的MTT是多大濃度的？怎么加200ul啊。 我用的MTT是2mg/ml的，每孔加50ul，（有的用5mg/ml，每孔加20ul），孵育3h后，加150ulDMSO溶解，用490nm和630nm測吸光值，也就是你說的檢測波長與參照波長。 吸光值最好在0.2-0.8范圍內(nèi)，因為這個是最準(zhǔn)確的。你測得值小，可能與接種的細(xì)胞量有關(guān)，還有就是MTT的用量。 數(shù)據(jù)處理時是需要相減的，即A490-A630。 |
3樓2010-01-08 11:30:43
1121prettycat
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4樓2010-01-08 14:19:05
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