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【求助/交流】如何同時提取DNA和RNA
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TRIzol試劑適用于從細(xì)胞和組織中快速分離RNA。TRIzol試劑有多組分分離作用，與其他方法如硫氰酸胍/酚法、酚/SDS法、鹽酸胍法、硫氰酸胍法等相比，最大特點(diǎn)是可同時分離一個樣品的RNA\DNA\蛋白質(zhì).TRIzol使樣品勻漿化，細(xì)胞裂解，溶解細(xì)胞內(nèi)含物，同時因含有RNase抑制劑可保持RNA的完整性。在加入氯仿離心后，溶液分為水相和有機(jī)相，RNA在水相中。取出水相用異丙醇沉淀可回收RNA；用乙醇沉淀中間層可回收DNA；用異丙醇沉淀有機(jī)相可回收蛋白質(zhì)。 TRIzol試劑可用于小量樣品（50～100mg組織、5×106細(xì)胞）也適用于大量樣品（≥1g組織、>107細(xì)胞）。對人，動物，植物組織，細(xì)菌均適用，可同時處理大量不同樣品，整個提取過程在一小時內(nèi)即可完成。分離的總RNA無蛋白質(zhì)和DNA污染，可用于Northern Blot，dot blot，ployA篩選，體外翻譯，RNase保護(hù)分析和分子克隆。在用于RT-PCR時如果兩條引物存在于一個單一外顯子內(nèi)，建議用無RNase的DNaseⅠ處理RNA樣品，避免出現(xiàn)假陽性。共純化的DNA可用作標(biāo)準(zhǔn)，比較不同樣品RNA的得率，也可用于PCR和酶切。蛋白質(zhì)可用于Western Blotting。 規(guī)格：100ml 黃色透明液體 儲存條件：2～8℃避光保存12個月 注意：請勿直接接觸皮膚或吞咽，以免灼傷。如接觸皮膚應(yīng)立即用洗滌劑和大量水沖洗。忌用乙醇擦洗，乙醇會加重灼傷程度。 預(yù)防RNase污染注意事項(xiàng)： 1.經(jīng)常更換新手套，皮膚上常帶有的細(xì)菌，霉菌可能成為RNase的來源。 2.使用滅過菌的RNA專用塑料制品避免交叉污染。 3.RNA在TRIzol試劑中時不會被RNase污染，但提取后繼續(xù)處理過程中應(yīng)使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150℃烘烤4小時，塑料制品可在0.5M NaOH中浸泡10分鐘，然后用水徹底清洗，高壓滅菌，即可去除RNase。 4.配制溶液應(yīng)使用無RNase的水（將水加入處理過不含RNase的玻璃瓶中，加入DEPC至終濃度0.01℅v/v，放置過夜，高壓滅菌 注：DEPC有致癌之嫌，需小心操作）。 RNA的提取 準(zhǔn)備試劑：氯仿，異丙醇，75℅乙醇，無RNase的水或0.5℅SDS（溶液均需用DEPC處理過的水配制）。 操作步驟： 1. 勻漿處理： a.組織將組織在液氮中磨碎，每50～100mg組織加入1ml TRIzol，用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10℅。 b.單層培養(yǎng)細(xì)胞 直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積（即3.5cm直徑的培養(yǎng)板）加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。 c.細(xì)胞懸液離心收集細(xì)胞，每5～10×106動物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1mlTRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。 2.將勻漿樣品在室溫（15～30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。 3.可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2～8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作。 4. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml氯仿，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。 5. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。 6. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相，進(jìn)一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1mlTRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。 7. 2～8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。 8. 用75℅乙醇洗滌RNA沉淀。每使用1ml TRIzol至少加1ml 75℅乙醇。2～8℃不超過7500×g離心5分鐘，棄上清。 9.室溫放置干燥或真空抽干RNA沉淀，大約晾5～10分鐘即可.不要真空離心干燥，過于干燥會導(dǎo)致RNA的溶解性大大降低。加入25～200μl無RNase的水或0.5℅SDS，用槍頭吸打幾次，55～60℃放置10分鐘使RNA溶解。如RNA用于酶切反應(yīng)，勿使用SDS溶液。RNA也可用100℅的去離子甲酰胺溶解，-70℃保存。 注意事項(xiàng)： 1.從少量樣品（1～10mg組織或102～104細(xì)胞）中提取RNA時可加入少許糖原以促進(jìn)RNA沉淀。例如加800mlTRIzol勻漿樣品，沉淀RNA前加5～10μgRNase-free糖原。糖原會與RNA一同沉淀出來，糖原濃度不高于4mg/ml是不影響第一鏈的合成，也不影響PCR反應(yīng)。 2.勻漿后加氯仿之前樣品可以在-60至-70℃保存至少一個月。RNA沉淀可以保存于75% 酒精中2～8℃一星期以上或-5至-20℃一年以上。 3.分層和RNA沉淀時也可使用臺式離心機(jī)，2600×g離心30～60分鐘。 預(yù)期產(chǎn)量：1mg組織或1×106細(xì)胞提取RNA分別為： 肝和脾6～10μg ，腎3～4μg ，骨骼肌和腦組織1～1.5μg ，胎盤1～4μg ，上皮細(xì)胞8～15μg ，成纖維細(xì)胞5～7μg 。 常見問題分析： 得率低： A.樣品裂解或勻漿處理不徹底。 B.RNA沉淀未完全溶解。 A260/A280<1.65 ： A.檢測吸光度時，RNA樣品沒有溶于水，而溶于了TE中。低離子濃度和低pH值條件下A280值偏高。 B.樣品勻漿時加的試劑量太少。 C.勻漿樣品時未在室溫放置5分鐘。 D.吸取水相時混入了有機(jī)相。 E.RNA沉淀未完全溶解。 RNA降解： A.組織取出后沒有馬上處理或冷凍。 B.待提取RNA的樣品沒有保存于-60至-70℃，而保存在了-5至-20℃。 C.細(xì)胞在用胰酶處理時過度。 D.溶液或離心管未經(jīng)RNase去除處理。 E.電泳時使用的甲醛pH值低于了3.5 。 DNA污染： A. 樣品勻漿時加的試劑量太少。 B.樣品中含有有機(jī)溶劑（如乙醇，DMSO等），強(qiáng)緩沖液或堿性溶液。 蛋白聚糖和多糖污染： 沉淀RNA的過程中作以下改進(jìn)可去除這些污染，步驟7中，每使用1ml TRIzol在水相中加0.25ml異丙醇和0.25ml高鹽溶液（0.8M檸檬酸鈉和1.2MNaCl）混合離心，按之前操作進(jìn)行。這種方法可使蛋白聚糖和多糖留在溶液中，高效沉淀出純RNA。從含有大量多糖的植物中提取RNA時應(yīng)在勻漿后離心，并加上以上操作步驟。 常見問題分析： 得率低： A.樣品勻漿和裂解的不徹底。 B.最終得到的DNA沉淀沒有完全溶解。 A260/A280<1.70 ： A. 檢測吸光度時，RNA樣品沒有溶于水，而溶于了TE中。 B.酚除去的不徹底，可用0.1M檸檬酸鈉（含10%乙醇）再洗一遍DNA沉淀。 DNA降解： A.組織取出后沒有馬上處理或冷凍。 B.待提取RNA的樣品沒有保存于-60至-70℃，而保存在了-5至-20℃。 C.樣品勻漿時使用了高速勻漿儀。 RNA污染： A.氯仿分層后水相去除的不干凈。 B.DNA沉淀用0.1M檸檬酸鈉（含10%乙醇）洗的不徹底。 蛋白質(zhì)的提取 準(zhǔn)備試劑：異丙醇含0.3M鹽酸胍的95%乙醇無水乙醇1%SDS。 操作步驟： 1.取沉淀DNA后剩余的上清，用異丙醇沉淀蛋白質(zhì)。每使用1ml TRIzol加1.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘，2～8℃12000×g離心10分鐘棄上清。 2.用含0.3M鹽酸胍的95%乙醇洗滌蛋白質(zhì)沉淀。每使用1mlTRIzol加2ml洗滌液，室溫放置20分鐘，2～8℃7500×g離心5分鐘，棄上清，重復(fù)兩次。用2ml無水乙醇同樣方法再洗一次。 3.真空抽干蛋白質(zhì)沉淀5～10分鐘，用1%SDS溶解蛋白質(zhì)，反復(fù)吸打，50℃溫浴使其完全溶解，不溶物2～8℃10000×g離心10分鐘除去。分離得到的蛋白質(zhì)樣品可用于Western Blot或-5至-20℃保存?zhèn)溆谩?br /> 注意事項(xiàng)： 1.蛋白質(zhì)沉淀可保存在含0.3M鹽酸胍的95%乙醇或無水乙醇中2～8℃一個月以上或-5至-20℃一年以上。 2.用0.1% SDS在2～8℃透析三次，10000×g離心10分鐘取上清即可用于Western Blot。 常見問題分析： 得率低： A.樣品裂解或勻漿處理不徹底。 B.最后得到的蛋白質(zhì)沉淀未完全溶解。 蛋白質(zhì)降解：組織取出后沒有馬上處理或冷凍。 電泳時條帶變形：蛋白質(zhì)沉淀洗滌不充分。 DNA的分離 準(zhǔn)備試劑：乙醇0.1M檸檬酸鈉（含10%乙醇） 75%乙醇8mM NaOH 操作步驟： 1. 樣品加氯仿分層后，移去上層水相，用乙醇沉淀中間層和有機(jī)相中的DNA。每使用1mlTRIzol加0.3ml無水乙醇混勻，室溫放置3分鐘，2～8℃不超過2000×g離心5分鐘。 2. 移去上清，（如需分離蛋白質(zhì)，可保留，進(jìn)一步操作見后）用含10%乙醇的0.1M檸檬酸鈉洗滌DNA沉淀。每用1mlTRIzol加入1ml檸檬酸鈉，室溫放置30分鐘，2～8℃2000×g離心5分鐘，棄上清，重復(fù)一次。 3. 用75%乙醇再洗一遍DNA沉淀，每用1ml TRIzol加入1.5～2 ml75%乙醇，室溫放置10～20分鐘（不時顛倒混合）2～8℃2000×g離心5分鐘， 棄上清。 4. 室溫放置晾干DNA 5～15分鐘，用8mM NaOH溶解DNA。從50～70mg組織或107細(xì)胞中分離的DNA溶于300～600μl 8mM NaOH，DNA的濃度通常為0.2～0.3μg/μl。提取的DNA沉淀不易溶于水和Tris緩沖液中，建議用弱堿溶解，8mMNaOH的pH值為9，溶解DNA后可用TE，HEPES調(diào)節(jié)pH。從某些樣品（尤其是組織）中提取的DNA中可能包含一些膠狀不溶物可>12000×g離心10分鐘除去。 DNA的定量：取一份溶于8mMNaOH的DNA加水測A260值。一單位A260值相當(dāng)于50μg/ml雙鏈DNA。根據(jù)DNA產(chǎn)量可估計細(xì)胞數(shù)，人、大鼠、小鼠1×106二倍體細(xì)胞含DNA的量分別為7.1μg，6.5μg，5.8μg。 預(yù)期產(chǎn)量：1mg組織或1×106細(xì)胞提取DNA分別為肝和腎3～4μg 骨骼肌，腦組織，胎盤2～3μg 人，大鼠，小鼠培養(yǎng)細(xì)胞（1×106）5～7μg 成纖維細(xì)胞5～7μg。 應(yīng)用： 1.用于PCR 溶于8mM NaOH的DNA用0.1M HEPES調(diào)pH至8.4，取0.1～1μg DNA用作模板。 2.酶切反應(yīng)用HEPES或1mM EDTA調(diào)節(jié)pH至適當(dāng)值。每μg DNA使用3～5單位的酶，80～90%的DNA是可消化的。 1ml 8mM NaOH溶解的DNA樣品pH值調(diào)節(jié) Final pH 0.1M HEPES（μl） Final pH 1M HEPES（μl） 8.4 86 7.2 23 8.2 93 7.0 32 8.0 101 7.8 117 7.5 159 注意事項(xiàng)： 1. DNA在中間層和有機(jī)相中時可在2～8℃保存過夜。 2.DNA沉淀在75%乙醇中2～8℃可保存幾個月。 3.DNA在8mM NaOH溶液中4℃可放置過夜，如長期保存需用HEPES調(diào)節(jié)pH至7～8并且加EDTA至1mM，可置于4℃或-20℃長期保存。 沒試過~~不保證成功 |
6樓2010-01-22 14:16:14
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