 |
 |
 |
| 24小時(shí)熱門(mén)版塊排行榜 |
- >論壇更新日志 (6130)
- >導(dǎo)師招生 (1275)
- >考研 (1189)
- >文獻(xiàn)求助 (452)
- >蟲(chóng)友互識(shí) (441)
- >休閑灌水 (232)
- >基金申請(qǐng) (166)
- >考博 (155)
- >招聘信息布告欄 (137)
- >碩博家園 (132)
- >論文投稿 (112)
- >博后之家 (91)
- >綠色求助(高懸賞) (45)
- >SciFinder/Reaxys (37)
- >論文道賀祈福 (33)
- >找工作 (33)
 |
 |
 |
||
 |
 |
 |
 |
 |
| 6 | 1/1 | 返回列表 |
| 查看: 1462 | 回復(fù): 5 | ||||
| 當(dāng)前主題已經(jīng)存檔。 | ||||
renchunxiao銀蟲(chóng) (小有名氣)
|
[交流]
【求助/交流】如何同時(shí)提取DNA和RNA
|
|||
| 大家有沒(méi)有好用的同時(shí)提取DNA和RNA的方法？試劑盒除外。 |
回復(fù)此樓» 收錄本帖的淘帖專輯推薦
 要學(xué)藥學(xué) |
» 猜你喜歡
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)中的趣事：實(shí)驗(yàn)器材的 “烏龍”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)中的趣事：和實(shí)驗(yàn)材料的 “斗智斗勇”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
化學(xué)工程及工業(yè)化學(xué)論文潤(rùn)色/翻譯怎么收費(fèi)?
已經(jīng)有241人回復(fù)
-
蛋白質(zhì)檢測(cè)：精準(zhǔn)分析，解鎖生物分子的密碼
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之小鼠實(shí)驗(yàn)：嚴(yán)謹(jǐn)設(shè)計(jì)，解析生命機(jī)制的重要載體
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之重金屬檢測(cè)：精準(zhǔn)篩查，守護(hù)健康與環(huán)境的防線
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之“蛙測(cè)重金屬我背鍋三千”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之“鼠逃三次我發(fā)三篇SCI”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
納米粒度分析
已經(jīng)有3人回復(fù)
-
林科院林化所招收材料與化工專業(yè)碩士，坐標(biāo)南京
已經(jīng)有0人回復(fù)
» 本主題相關(guān)商家推薦: (我也要在這里推廣)
yujiaping1
木蟲(chóng) (著名寫(xiě)手)
- MolEPI: 3
- 應(yīng)助: 1 (幼兒園)
- 金幣: 1365.2
- 散金: 10
- 紅花: 5
- 帖子: 1174
- 在線: 66.6小時(shí)
- 蟲(chóng)號(hào): 929883
- 注冊(cè): 2009-12-17
- 性別: MM
- 專業(yè): 疫苗學(xué)
2樓2010-01-22 13:23:21
yangym1123
木蟲(chóng) (小有名氣)
- 應(yīng)助: 1 (幼兒園)
- 金幣: 1963.2
- 帖子: 230
- 在線: 30.2小時(shí)
- 蟲(chóng)號(hào): 397777
- 注冊(cè): 2007-06-10
- 專業(yè): 動(dòng)物形態(tài)學(xué)及胚胎學(xué)
3樓2010-01-22 13:40:41
三磷酸腺苷
鐵桿木蟲(chóng) (職業(yè)作家)
- MolEPI: 7
- 應(yīng)助: 1 (幼兒園)
- 貴賓: 0.021
- 金幣: 7298.5
- 散金: 9
- 紅花: 13
- 帖子: 4032
- 在線: 224.7小時(shí)
- 蟲(chóng)號(hào): 551611
- 注冊(cè): 2008-04-27
- 性別: GG
- 專業(yè): 神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤（含特殊感受
4樓2010-01-22 13:55:34
towindflower
新蟲(chóng) (初入文壇)
- 應(yīng)助: 0 (幼兒園)
- 金幣: 16.6
- 帖子: 27
- 在線: 6小時(shí)
- 蟲(chóng)號(hào): 938977
- 注冊(cè): 2010-01-08
- 性別: GG
- 專業(yè): 生命科學(xué)
5樓2010-01-22 14:01:19
三磷酸腺苷
鐵桿木蟲(chóng) (職業(yè)作家)
- MolEPI: 7
- 應(yīng)助: 1 (幼兒園)
- 貴賓: 0.021
- 金幣: 7298.5
- 散金: 9
- 紅花: 13
- 帖子: 4032
- 在線: 224.7小時(shí)
- 蟲(chóng)號(hào): 551611
- 注冊(cè): 2008-04-27
- 性別: GG
- 專業(yè): 神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤（含特殊感受
★
小木蟲(chóng)(金幣+0.5):給個(gè)紅包，謝謝回帖交流
小木蟲(chóng)(金幣+0.5):給個(gè)紅包，謝謝回帖交流
|
TRIzol試劑適用于從細(xì)胞和組織中快速分離RNA。TRIzol試劑有多組分分離作用，與其他方法如硫氰酸胍/酚法、酚/SDS法、鹽酸胍法、硫氰酸胍法等相比，最大特點(diǎn)是可同時(shí)分離一個(gè)樣品的RNA\DNA\蛋白質(zhì).TRIzol使樣品勻漿化，細(xì)胞裂解，溶解細(xì)胞內(nèi)含物，同時(shí)因含有RNase抑制劑可保持RNA的完整性。在加入氯仿離心后，溶液分為水相和有機(jī)相，RNA在水相中。取出水相用異丙醇沉淀可回收RNA；用乙醇沉淀中間層可回收DNA；用異丙醇沉淀有機(jī)相可回收蛋白質(zhì)。 TRIzol試劑可用于小量樣品（50～100mg組織、5×106細(xì)胞）也適用于大量樣品（≥1g組織、>107細(xì)胞）。對(duì)人，動(dòng)物，植物組織，細(xì)菌均適用，可同時(shí)處理大量不同樣品，整個(gè)提取過(guò)程在一小時(shí)內(nèi)即可完成。分離的總RNA無(wú)蛋白質(zhì)和DNA污染，可用于Northern Blot，dot blot，ployA篩選，體外翻譯，RNase保護(hù)分析和分子克隆。在用于RT-PCR時(shí)如果兩條引物存在于一個(gè)單一外顯子內(nèi)，建議用無(wú)RNase的DNaseⅠ處理RNA樣品，避免出現(xiàn)假陽(yáng)性。共純化的DNA可用作標(biāo)準(zhǔn)，比較不同樣品RNA的得率，也可用于PCR和酶切。蛋白質(zhì)可用于Western Blotting。 規(guī)格：100ml 黃色透明液體 儲(chǔ)存條件：2～8℃避光保存12個(gè)月 注意：請(qǐng)勿直接接觸皮膚或吞咽，以免灼傷。如接觸皮膚應(yīng)立即用洗滌劑和大量水沖洗。忌用乙醇擦洗，乙醇會(huì)加重灼傷程度。 預(yù)防RNase污染注意事項(xiàng)： 1.經(jīng)常更換新手套，皮膚上常帶有的細(xì)菌，霉菌可能成為RNase的來(lái)源。 2.使用滅過(guò)菌的RNA專用塑料制品避免交叉污染。 3.RNA在TRIzol試劑中時(shí)不會(huì)被RNase污染，但提取后繼續(xù)處理過(guò)程中應(yīng)使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150℃烘烤4小時(shí)，塑料制品可在0.5M NaOH中浸泡10分鐘，然后用水徹底清洗，高壓滅菌，即可去除RNase。 4.配制溶液應(yīng)使用無(wú)RNase的水（將水加入處理過(guò)不含RNase的玻璃瓶中，加入DEPC至終濃度0.01℅v/v，放置過(guò)夜，高壓滅菌 注：DEPC有致癌之嫌，需小心操作）。 RNA的提取 準(zhǔn)備試劑：氯仿，異丙醇，75℅乙醇，無(wú)RNase的水或0.5℅SDS（溶液均需用DEPC處理過(guò)的水配制）。 操作步驟： 1. 勻漿處理： a.組織將組織在液氮中磨碎，每50～100mg組織加入1ml TRIzol，用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過(guò)TRIzol體積10℅。 b.單層培養(yǎng)細(xì)胞 直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積（即3.5cm直徑的培養(yǎng)板）加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。 c.細(xì)胞懸液離心收集細(xì)胞，每5～10×106動(dòng)物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1mlTRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。 2.將勻漿樣品在室溫（15～30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。 3.可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2～8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時(shí)，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作。 4. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml氯仿，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。 5. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無(wú)色水相和一個(gè)中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。 6. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相，進(jìn)一步操作見(jiàn)后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1mlTRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。 7. 2～8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。 8. 用75℅乙醇洗滌RNA沉淀。每使用1ml TRIzol至少加1ml 75℅乙醇。2～8℃不超過(guò)7500×g離心5分鐘，棄上清。 9.室溫放置干燥或真空抽干RNA沉淀，大約晾5～10分鐘即可.不要真空離心干燥，過(guò)于干燥會(huì)導(dǎo)致RNA的溶解性大大降低。加入25～200μl無(wú)RNase的水或0.5℅SDS，用槍頭吸打幾次，55～60℃放置10分鐘使RNA溶解。如RNA用于酶切反應(yīng)，勿使用SDS溶液。RNA也可用100℅的去離子甲酰胺溶解，-70℃保存。 注意事項(xiàng)： 1.從少量樣品（1～10mg組織或102～104細(xì)胞）中提取RNA時(shí)可加入少許糖原以促進(jìn)RNA沉淀。例如加800mlTRIzol勻漿樣品，沉淀RNA前加5～10μgRNase-free糖原。糖原會(huì)與RNA一同沉淀出來(lái)，糖原濃度不高于4mg/ml是不影響第一鏈的合成，也不影響PCR反應(yīng)。 2.勻漿后加氯仿之前樣品可以在-60至-70℃保存至少一個(gè)月。RNA沉淀可以保存于75% 酒精中2～8℃一星期以上或-5至-20℃一年以上。 3.分層和RNA沉淀時(shí)也可使用臺(tái)式離心機(jī)，2600×g離心30～60分鐘。 預(yù)期產(chǎn)量：1mg組織或1×106細(xì)胞提取RNA分別為： 肝和脾6～10μg ，腎3～4μg ，骨骼肌和腦組織1～1.5μg ，胎盤(pán)1～4μg ，上皮細(xì)胞8～15μg ，成纖維細(xì)胞5～7μg 。 常見(jiàn)問(wèn)題分析： 得率低： A.樣品裂解或勻漿處理不徹底。 B.RNA沉淀未完全溶解。 A260/A280<1.65 ： A.檢測(cè)吸光度時(shí)，RNA樣品沒(méi)有溶于水，而溶于了TE中。低離子濃度和低pH值條件下A280值偏高。 B.樣品勻漿時(shí)加的試劑量太少。 C.勻漿樣品時(shí)未在室溫放置5分鐘。 D.吸取水相時(shí)混入了有機(jī)相。 E.RNA沉淀未完全溶解。 RNA降解： A.組織取出后沒(méi)有馬上處理或冷凍。 B.待提取RNA的樣品沒(méi)有保存于-60至-70℃，而保存在了-5至-20℃。 C.細(xì)胞在用胰酶處理時(shí)過(guò)度。 D.溶液或離心管未經(jīng)RNase去除處理。 E.電泳時(shí)使用的甲醛pH值低于了3.5 。 DNA污染： A. 樣品勻漿時(shí)加的試劑量太少。 B.樣品中含有有機(jī)溶劑（如乙醇，DMSO等），強(qiáng)緩沖液或堿性溶液。 蛋白聚糖和多糖污染： 沉淀RNA的過(guò)程中作以下改進(jìn)可去除這些污染，步驟7中，每使用1ml TRIzol在水相中加0.25ml異丙醇和0.25ml高鹽溶液（0.8M檸檬酸鈉和1.2MNaCl）混合離心，按之前操作進(jìn)行。這種方法可使蛋白聚糖和多糖留在溶液中，高效沉淀出純RNA。從含有大量多糖的植物中提取RNA時(shí)應(yīng)在勻漿后離心，并加上以上操作步驟。 常見(jiàn)問(wèn)題分析： 得率低： A.樣品勻漿和裂解的不徹底。 B.最終得到的DNA沉淀沒(méi)有完全溶解。 A260/A280<1.70 ： A. 檢測(cè)吸光度時(shí)，RNA樣品沒(méi)有溶于水，而溶于了TE中。 B.酚除去的不徹底，可用0.1M檸檬酸鈉（含10%乙醇）再洗一遍DNA沉淀。 DNA降解： A.組織取出后沒(méi)有馬上處理或冷凍。 B.待提取RNA的樣品沒(méi)有保存于-60至-70℃，而保存在了-5至-20℃。 C.樣品勻漿時(shí)使用了高速勻漿儀。 RNA污染： A.氯仿分層后水相去除的不干凈。 B.DNA沉淀用0.1M檸檬酸鈉（含10%乙醇）洗的不徹底。 蛋白質(zhì)的提取 準(zhǔn)備試劑：異丙醇含0.3M鹽酸胍的95%乙醇無(wú)水乙醇1%SDS。 操作步驟： 1.取沉淀DNA后剩余的上清，用異丙醇沉淀蛋白質(zhì)。每使用1ml TRIzol加1.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘，2～8℃12000×g離心10分鐘棄上清。 2.用含0.3M鹽酸胍的95%乙醇洗滌蛋白質(zhì)沉淀。每使用1mlTRIzol加2ml洗滌液，室溫放置20分鐘，2～8℃7500×g離心5分鐘，棄上清，重復(fù)兩次。用2ml無(wú)水乙醇同樣方法再洗一次。 3.真空抽干蛋白質(zhì)沉淀5～10分鐘，用1%SDS溶解蛋白質(zhì)，反復(fù)吸打，50℃溫浴使其完全溶解，不溶物2～8℃10000×g離心10分鐘除去。分離得到的蛋白質(zhì)樣品可用于Western Blot或-5至-20℃保存?zhèn)溆谩?br /> 注意事項(xiàng)： 1.蛋白質(zhì)沉淀可保存在含0.3M鹽酸胍的95%乙醇或無(wú)水乙醇中2～8℃一個(gè)月以上或-5至-20℃一年以上。 2.用0.1% SDS在2～8℃透析三次，10000×g離心10分鐘取上清即可用于Western Blot。 常見(jiàn)問(wèn)題分析： 得率低： A.樣品裂解或勻漿處理不徹底。 B.最后得到的蛋白質(zhì)沉淀未完全溶解。 蛋白質(zhì)降解：組織取出后沒(méi)有馬上處理或冷凍。 電泳時(shí)條帶變形：蛋白質(zhì)沉淀洗滌不充分。 DNA的分離 準(zhǔn)備試劑：乙醇0.1M檸檬酸鈉（含10%乙醇） 75%乙醇8mM NaOH 操作步驟： 1. 樣品加氯仿分層后，移去上層水相，用乙醇沉淀中間層和有機(jī)相中的DNA。每使用1mlTRIzol加0.3ml無(wú)水乙醇混勻，室溫放置3分鐘，2～8℃不超過(guò)2000×g離心5分鐘。 2. 移去上清，（如需分離蛋白質(zhì)，可保留，進(jìn)一步操作見(jiàn)后）用含10%乙醇的0.1M檸檬酸鈉洗滌DNA沉淀。每用1mlTRIzol加入1ml檸檬酸鈉，室溫放置30分鐘，2～8℃2000×g離心5分鐘，棄上清，重復(fù)一次。 3. 用75%乙醇再洗一遍DNA沉淀，每用1ml TRIzol加入1.5～2 ml75%乙醇，室溫放置10～20分鐘（不時(shí)顛倒混合）2～8℃2000×g離心5分鐘， 棄上清。 4. 室溫放置晾干DNA 5～15分鐘，用8mM NaOH溶解DNA。從50～70mg組織或107細(xì)胞中分離的DNA溶于300～600μl 8mM NaOH，DNA的濃度通常為0.2～0.3μg/μl。提取的DNA沉淀不易溶于水和Tris緩沖液中，建議用弱堿溶解，8mMNaOH的pH值為9，溶解DNA后可用TE，HEPES調(diào)節(jié)pH。從某些樣品（尤其是組織）中提取的DNA中可能包含一些膠狀不溶物可>12000×g離心10分鐘除去。 DNA的定量：取一份溶于8mMNaOH的DNA加水測(cè)A260值。一單位A260值相當(dāng)于50μg/ml雙鏈DNA。根據(jù)DNA產(chǎn)量可估計(jì)細(xì)胞數(shù)，人、大鼠、小鼠1×106二倍體細(xì)胞含DNA的量分別為7.1μg，6.5μg，5.8μg。 預(yù)期產(chǎn)量：1mg組織或1×106細(xì)胞提取DNA分別為肝和腎3～4μg 骨骼肌，腦組織，胎盤(pán)2～3μg 人，大鼠，小鼠培養(yǎng)細(xì)胞（1×106）5～7μg 成纖維細(xì)胞5～7μg。 應(yīng)用： 1.用于PCR 溶于8mM NaOH的DNA用0.1M HEPES調(diào)pH至8.4，取0.1～1μg DNA用作模板。 2.酶切反應(yīng)用HEPES或1mM EDTA調(diào)節(jié)pH至適當(dāng)值。每μg DNA使用3～5單位的酶，80～90%的DNA是可消化的。 1ml 8mM NaOH溶解的DNA樣品pH值調(diào)節(jié) Final pH 0.1M HEPES（μl） Final pH 1M HEPES（μl） 8.4 86 7.2 23 8.2 93 7.0 32 8.0 101 7.8 117 7.5 159 注意事項(xiàng)： 1. DNA在中間層和有機(jī)相中時(shí)可在2～8℃保存過(guò)夜。 2.DNA沉淀在75%乙醇中2～8℃可保存幾個(gè)月。 3.DNA在8mM NaOH溶液中4℃可放置過(guò)夜，如長(zhǎng)期保存需用HEPES調(diào)節(jié)pH至7～8并且加EDTA至1mM，可置于4℃或-20℃長(zhǎng)期保存。 沒(méi)試過(guò)~~不保證成功 |
6樓2010-01-22 14:16:14
相關(guān)版塊跳轉(zhuǎn)
我要訂閱樓主 renchunxiao 的主題更新
| 6 | 1/1 | 返回列表 |
| 最具人氣熱帖推薦 [查看全部] | 作者 | 回/看 | 最后發(fā)表 | |
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 304求調(diào)劑 +8 | 小熊joy 2026-03-14 | 8/400 |
|
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 材料工程專碩調(diào)劑 +5 | 204818@lcx 2026-03-17 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 考研化學(xué)學(xué)碩調(diào)劑，一志愿985 +4 | 張vvvv 2026-03-15 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 085601求調(diào)劑 +4 | Du.11 2026-03-16 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 本人考085602 化學(xué)工程 專碩 +16 | 不知道叫什么！ 2026-03-15 | 18/900 |
|
|
|
[考研] 26考研求調(diào)劑 +6 | 丶宏Sir 2026-03-13 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 285化工學(xué)碩求調(diào)劑（081700） +9 | 柴郡貓_ 2026-03-12 | 9/450 |
|
|
|
[考研] 278求調(diào)劑 +3 | Yy7400 2026-03-13 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 274求調(diào)劑 +5 | 時(shí)間點(diǎn) 2026-03-13 | 5/250 |
|
|
|
[基金申請(qǐng)] 國(guó)自科面上基金字體 +6 | iwuli 2026-03-12 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 機(jī)械專碩325，尋找調(diào)劑院校 +3 | y9999 2026-03-15 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 一志愿985，本科211，0817化學(xué)工程與技術(shù)319求調(diào)劑 +5 | Liwangman 2026-03-15 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 311求調(diào)劑 +5 | 26研0 2026-03-15 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 070303 總分349求調(diào)劑 +3 | LJY9966 2026-03-15 | 5/250 |
|
|
|
[考研]
 機(jī)械專碩調(diào)劑
+3
|
笨笨兔子 2026-03-12 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 085601材料工程315分求調(diào)劑 +3 | yang_0104 2026-03-15 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 304求調(diào)劑 +6 | Mochaaaa 2026-03-12 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 求調(diào)劑（材料與化工327） +4 | 愛(ài)吃香菜啦 2026-03-11 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 281求調(diào)劑 +9 | Koxui 2026-03-12 | 11/550 |
|
|
|
[考博] 福州大學(xué)楊黃浩課題組招收2026年專業(yè)學(xué)位博士研究生，2026.03.20截止 +3 | Xiangyu_ou 2026-03-12 | 3/150 |
|