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[交流]
【求助/交流】請(qǐng)教關(guān)于大腸桿菌lamda RED重組問(wèn)題 已有17人參與
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最近用lamda RED重組敲除大腸桿菌乳酸脫氫酶基因�？墒且恢背鰡�(wèn)題，分析不出來(lái)問(wèn)題出在哪里，所以向各位大俠請(qǐng)教。以下是我的實(shí)驗(yàn)方法： 1、用帶有45bp同源臂的引物，PCR擴(kuò)增卡那霉素或氯霉素基因； 2、用切膠回收的方法純化PCR產(chǎn)物，100微升PCR產(chǎn)物最終濃縮為50微升； 3、含有PKD46質(zhì)粒的E. coli W1485菌株（K-12菌株變種）在LB中培養(yǎng)，OD＝0.2時(shí)加入L－Ara誘導(dǎo)酶?jìng)儽磉_(dá)，OD在0.5左右用CaCl2制作感受態(tài)； 4、化學(xué)轉(zhuǎn)化，而后涂卡那霉素（40ppm）平板； 5、一天后長(zhǎng)出幾十個(gè)菌落（據(jù)說(shuō)RED重組效率很低，只能長(zhǎng)出幾個(gè)菌落來(lái)，偶為什么會(huì)長(zhǎng)這么多？），每個(gè)菌落，接到兩個(gè)平板上，其中一個(gè)帶氨芐青霉素和卡那霉素抗性，另外一個(gè)只有卡那霉素抗性；挑出只在卡那霉素平板上生長(zhǎng)的菌株，擴(kuò)大培養(yǎng)（加了卡那霉素的液體LB培養(yǎng)基）； 6、擴(kuò)大培養(yǎng)的菌提取基因組DNA（電泳的時(shí)候沒(méi)有發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒的條帶），用PCR擴(kuò)增卡那霉素抗性基因，擴(kuò)增不出來(lái)…… 為什么出現(xiàn)6這個(gè)現(xiàn)象？做了好幾組，總是不成功，菌種從W1485換成BL21也不行…… 為什么會(huì)有這些假陽(yáng)性？ |
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1949stone(金幣+4): 2010-04-11 18:49
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1、用帶有45bp同源臂的引物，PCR擴(kuò)增卡那霉素或氯霉素基因； 同源臂可以延長(zhǎng)。 2、用切膠回收的方法純化PCR產(chǎn)物，100微升PCR產(chǎn)物最終濃縮為50微升； 你用什么酶P的，文獻(xiàn)上說(shuō)是taq加pfu，DpnI消化降解pKD3/4模板。 3、含有PKD46質(zhì)粒的E. coli W1485菌株（K-12菌株變種）在LB中培養(yǎng)，OD＝0.2時(shí)加入L－Ara誘導(dǎo)酶?jìng)儽磉_(dá)，OD在0.5左右用CaCl2制作感受態(tài)； ara濃度是多少，文獻(xiàn)說(shuō)在初始期即加入，1mM或10mM，這要看菌里有沒(méi)有araBAD這幾個(gè)基因，另外，一定是30度做感受態(tài)，一定是電轉(zhuǎn)。 4、化學(xué)轉(zhuǎn)化，而后涂卡那霉素（40ppm）平板； 40ppm是多少，文獻(xiàn)是25ug/mL。 5、一天后長(zhǎng)出幾十個(gè)菌落（據(jù)說(shuō)RED重組效率很低，只能長(zhǎng)出幾個(gè)菌落來(lái)，偶為什么會(huì)長(zhǎng)這么多？），每個(gè)菌落，接到兩個(gè)平板上，其中一個(gè)帶氨芐青霉素和卡那霉素抗性，另外一個(gè)只有卡那霉素抗性；挑出只在卡那霉素平板上生長(zhǎng)的菌株，擴(kuò)大培養(yǎng)（加了卡那霉素的液體LB培養(yǎng)基）； 這一步?jīng)]必要，可以先篩到重組子，再去消除pKD46 6、擴(kuò)大培養(yǎng)的菌提取基因組DNA（電泳的時(shí)候沒(méi)有發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒的條帶），用PCR擴(kuò)增卡那霉素抗性基因，擴(kuò)增不出來(lái)…… 不用提DNA，菌落PCR就夠了，引物要設(shè)在同源臂兩側(cè)，而不是用抗性基因引物去P。 |
3樓2010-04-11 18:35:35
zhangjingfei01
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7樓2010-04-12 11:17:47
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這個(gè)問(wèn)題我也遇到了主要解決方案： 1.縮短阿拉伯糖有到時(shí)間（1h足夠，文獻(xiàn)中給出的最小20min），誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)會(huì)使得自發(fā)突變的頻率加大。 2.想辦法用電轉(zhuǎn)化，文獻(xiàn)中一般都是用的電轉(zhuǎn)化。 3.如果你缺失的這個(gè)基因?qū)δ氵@個(gè)菌本身很重要，缺失以后會(huì)致死，你也不能得到正確結(jié)果。 我現(xiàn)在在宿舍，關(guān)于相關(guān)文獻(xiàn)你若需要明天可以到實(shí)驗(yàn)室后發(fā)給你，希望對(duì)你有幫助。 |
18樓2011-05-29 23:28:56
zhuifeng7000
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1.PCR擴(kuò)增同源臂后未降解模板，這可能是后來(lái)出現(xiàn)假陽(yáng)性的主要原因； 2.是否考慮電轉(zhuǎn)化提高轉(zhuǎn)化效率？ 3.轉(zhuǎn)化后用雙抗板篩選陽(yáng)性克��； 4.轉(zhuǎn)化前培養(yǎng)菌體用的溫度是多少？ 5.你的第6步進(jìn)行PCR時(shí)是否有陽(yáng)性和陰性對(duì)照？可能是你PCR有問(wèn)題而非菌的問(wèn)題。 |
2樓2010-04-11 16:38:49
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多謝兄臺(tái)建議；還有以下問(wèn)題需要請(qǐng)教： 1、PCR切膠回收的，回收1.5/1.0左右片段；而且事后為了檢查是否有假陽(yáng)性，我還專(zhuān)門(mén)從陽(yáng)性克隆提純質(zhì)粒檢測(cè)——檢測(cè)結(jié)果沒(méi)有質(zhì)粒； 2、我也一直在考慮是不是化學(xué)轉(zhuǎn)化的問(wèn)題，但是無(wú)奈實(shí)驗(yàn)室不具備電轉(zhuǎn)條件； 3、沒(méi)問(wèn)題，不過(guò)又得多一步刪除PKD46步驟； 4、制作感受態(tài)培養(yǎng)溫度為30度； 5、做PCR時(shí)候，1）設(shè)沒(méi)有轉(zhuǎn)化的菌株的基因組DNA為陰性對(duì)照，這個(gè)擴(kuò)增不出目的片段；2）設(shè)PKD3/PKD4質(zhì)粒為陽(yáng)性對(duì)照陰性對(duì)照，這個(gè)可以擴(kuò)增出目的片段;3）設(shè)擴(kuò)增大腸桿菌基因組上異檸檬酸裂解酶（因?yàn)檫@個(gè)基因大小與卡那霉素抗性基因相似）作為PCR體系判斷實(shí)驗(yàn)，這個(gè)可以擴(kuò)增出目的片段； 綜上，實(shí)驗(yàn)仍然沒(méi)有成功，還請(qǐng)仁兄根據(jù)以上條件，提出進(jìn)一步建議。 先行謝過(guò)！ [ Last edited by hanjun80 on 2010-4-11 at 20:44 ] |
4樓2010-04-11 20:33:50
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多謝兄臺(tái)建議！ 我做過(guò)進(jìn)一步的改進(jìn)實(shí)驗(yàn)，如下，請(qǐng)您根據(jù)這些，幫忙分析一下原因： 1、我用的酶是fermentas的pfu酶；我沒(méi)有用DpnI降解模版質(zhì)粒；但事后我用堿裂法提取陽(yáng)性克隆的質(zhì)粒，并沒(méi)有提出來(lái)； 2、W1485的araBAD基因沒(méi)有失活，所以我用的L－ara濃度是10mM； 3、因?yàn)閷?shí)驗(yàn)室不具備電轉(zhuǎn)條件，所以只能用化學(xué)轉(zhuǎn)化； 4、40ppm的卡納霉素就是40ug/mL；但是我用的氯霉素是8ug/mL； 5、因?yàn)榫銹CR擴(kuò)增不出來(lái)，所以才用基因組DNA擴(kuò)增，但是我像上位仁兄的建議那樣，我做了陰性和陽(yáng)性對(duì)照實(shí)驗(yàn)了…… 請(qǐng)您幫助根據(jù)以上的這些信息進(jìn)一步分析下原因，先行謝過(guò) |
5樓2010-04-11 20:42:54
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hanjun80(金幣+1):謝謝參與
hanjun80(金幣+3):多謝仁兄建議 2010-04-12 13:11
lstt09nk(金幣+3):感謝交流~~很熱心~~ 2010-08-08 21:35:56
hanjun80(金幣+1):謝謝參與
hanjun80(金幣+3):多謝仁兄建議 2010-04-12 13:11
lstt09nk(金幣+3):感謝交流~~很熱心~~ 2010-08-08 21:35:56
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氯化鈣轉(zhuǎn)化恐怕是最大的問(wèn)題吧。我沒(méi)有看到文獻(xiàn)上說(shuō)用氯化鈣方法轉(zhuǎn)化DNA片段的，盡量聯(lián)系下用電轉(zhuǎn)吧。還有就是DNA片段的濃度和感受態(tài)細(xì)胞的濃度在做高些吧。DNA我們最后都是濃縮到500~1000ng/ul,電轉(zhuǎn)時(shí)100ul的細(xì)胞加1ul片段。 1、我用的酶是fermentas的pfu酶；我沒(méi)有用DpnI降解模版質(zhì)粒；但事后我用堿裂法提取陽(yáng)性克隆的質(zhì)粒，并沒(méi)有提出來(lái)； 這一步我們也不降解，pcr結(jié)束后切膠回收，純化濃縮。 2、W1485的araBAD基因沒(méi)有失活，所以我用的L－ara濃度是10mM； 這一步?jīng)]什么為問(wèn)題，可以一開(kāi)始就加，也可以O(shè)D在0.1~0.2之間加，最后可以多養(yǎng)會(huì)，我們一般養(yǎng)到OD0.7左右。 3、因?yàn)閷?shí)驗(yàn)室不具備電轉(zhuǎn)條件，所以只能用化學(xué)轉(zhuǎn)化； 這個(gè)化學(xué)轉(zhuǎn)化恐怕不行吧 4、40ppm的卡納霉素就是40ug/mL；但是我用的氯霉素是8ug/mL； 氯霉素太低了些 5、因?yàn)榫銹CR擴(kuò)增不出來(lái)，所以才用基因組DNA擴(kuò)增，但是我像上位仁兄的建議那樣，我做了陰性和陽(yáng)性對(duì)照實(shí)驗(yàn)了…… |
6樓2010-04-12 08:38:55
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