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[交流]
【求助/交流】請教關(guān)于大腸桿菌lamda RED重組問題 已有17人參與
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最近用lamda RED重組敲除大腸桿菌乳酸脫氫酶基因�？墒且恢背鰡栴}，分析不出來問題出在哪里，所以向各位大俠請教。以下是我的實驗方法： 1、用帶有45bp同源臂的引物，PCR擴增卡那霉素或氯霉素基因； 2、用切膠回收的方法純化PCR產(chǎn)物，100微升PCR產(chǎn)物最終濃縮為50微升； 3、含有PKD46質(zhì)粒的E. coli W1485菌株（K-12菌株變種）在LB中培養(yǎng)，OD＝0.2時加入L－Ara誘導(dǎo)酶們表達，OD在0.5左右用CaCl2制作感受態(tài)； 4、化學(xué)轉(zhuǎn)化，而后涂卡那霉素（40ppm）平板； 5、一天后長出幾十個菌落（據(jù)說RED重組效率很低，只能長出幾個菌落來，偶為什么會長這么多？），每個菌落，接到兩個平板上，其中一個帶氨芐青霉素和卡那霉素抗性，另外一個只有卡那霉素抗性；挑出只在卡那霉素平板上生長的菌株，擴大培養(yǎng)（加了卡那霉素的液體LB培養(yǎng)基）； 6、擴大培養(yǎng)的菌提取基因組DNA（電泳的時候沒有發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒的條帶），用PCR擴增卡那霉素抗性基因，擴增不出來…… 為什么出現(xiàn)6這個現(xiàn)象？做了好幾組，總是不成功，菌種從W1485換成BL21也不行…… 為什么會有這些假陽性？ |
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1949stone(金幣+4): 2010-04-11 18:49
hanjun80(金幣+3):多謝熱心回復(fù)！ 2010-04-11 20:10
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1、用帶有45bp同源臂的引物，PCR擴增卡那霉素或氯霉素基因； 同源臂可以延長。 2、用切膠回收的方法純化PCR產(chǎn)物，100微升PCR產(chǎn)物最終濃縮為50微升； 你用什么酶P的，文獻上說是taq加pfu，DpnI消化降解pKD3/4模板。 3、含有PKD46質(zhì)粒的E. coli W1485菌株（K-12菌株變種）在LB中培養(yǎng)，OD＝0.2時加入L－Ara誘導(dǎo)酶們表達，OD在0.5左右用CaCl2制作感受態(tài)； ara濃度是多少，文獻說在初始期即加入，1mM或10mM，這要看菌里有沒有araBAD這幾個基因，另外，一定是30度做感受態(tài)，一定是電轉(zhuǎn)。 4、化學(xué)轉(zhuǎn)化，而后涂卡那霉素（40ppm）平板； 40ppm是多少，文獻是25ug/mL。 5、一天后長出幾十個菌落（據(jù)說RED重組效率很低，只能長出幾個菌落來，偶為什么會長這么多？），每個菌落，接到兩個平板上，其中一個帶氨芐青霉素和卡那霉素抗性，另外一個只有卡那霉素抗性；挑出只在卡那霉素平板上生長的菌株，擴大培養(yǎng)（加了卡那霉素的液體LB培養(yǎng)基）； 這一步?jīng)]必要，可以先篩到重組子，再去消除pKD46 6、擴大培養(yǎng)的菌提取基因組DNA（電泳的時候沒有發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒的條帶），用PCR擴增卡那霉素抗性基因，擴增不出來…… 不用提DNA，菌落PCR就夠了，引物要設(shè)在同源臂兩側(cè)，而不是用抗性基因引物去P。 |
3樓2010-04-11 18:35:35
zhangjingfei01
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7樓2010-04-12 11:17:47
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18樓2011-05-29 23:28:56
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1.PCR擴增同源臂后未降解模板，這可能是后來出現(xiàn)假陽性的主要原因； 2.是否考慮電轉(zhuǎn)化提高轉(zhuǎn)化效率？ 3.轉(zhuǎn)化后用雙抗板篩選陽性克��； 4.轉(zhuǎn)化前培養(yǎng)菌體用的溫度是多少？ 5.你的第6步進行PCR時是否有陽性和陰性對照？可能是你PCR有問題而非菌的問題。 |
2樓2010-04-11 16:38:49
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多謝兄臺建議；還有以下問題需要請教： 1、PCR切膠回收的，回收1.5/1.0左右片段；而且事后為了檢查是否有假陽性，我還專門從陽性克隆提純質(zhì)粒檢測——檢測結(jié)果沒有質(zhì)粒； 2、我也一直在考慮是不是化學(xué)轉(zhuǎn)化的問題，但是無奈實驗室不具備電轉(zhuǎn)條件； 3、沒問題，不過又得多一步刪除PKD46步驟； 4、制作感受態(tài)培養(yǎng)溫度為30度； 5、做PCR時候，1）設(shè)沒有轉(zhuǎn)化的菌株的基因組DNA為陰性對照，這個擴增不出目的片段；2）設(shè)PKD3/PKD4質(zhì)粒為陽性對照陰性對照，這個可以擴增出目的片段;3）設(shè)擴增大腸桿菌基因組上異檸檬酸裂解酶（因為這個基因大小與卡那霉素抗性基因相似）作為PCR體系判斷實驗，這個可以擴增出目的片段； 綜上，實驗仍然沒有成功，還請仁兄根據(jù)以上條件，提出進一步建議。 先行謝過！ [ Last edited by hanjun80 on 2010-4-11 at 20:44 ] |
4樓2010-04-11 20:33:50
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多謝兄臺建議！ 我做過進一步的改進實驗，如下，請您根據(jù)這些，幫忙分析一下原因： 1、我用的酶是fermentas的pfu酶；我沒有用DpnI降解模版質(zhì)粒；但事后我用堿裂法提取陽性克隆的質(zhì)粒，并沒有提出來； 2、W1485的araBAD基因沒有失活，所以我用的L－ara濃度是10mM； 3、因為實驗室不具備電轉(zhuǎn)條件，所以只能用化學(xué)轉(zhuǎn)化； 4、40ppm的卡納霉素就是40ug/mL；但是我用的氯霉素是8ug/mL； 5、因為菌落PCR擴增不出來，所以才用基因組DNA擴增，但是我像上位仁兄的建議那樣，我做了陰性和陽性對照實驗了…… 請您幫助根據(jù)以上的這些信息進一步分析下原因，先行謝過 |
5樓2010-04-11 20:42:54
★ ★ ★ ★
hanjun80(金幣+1):謝謝參與
hanjun80(金幣+3):多謝仁兄建議 2010-04-12 13:11
lstt09nk(金幣+3):感謝交流~~很熱心~~ 2010-08-08 21:35:56
hanjun80(金幣+1):謝謝參與
hanjun80(金幣+3):多謝仁兄建議 2010-04-12 13:11
lstt09nk(金幣+3):感謝交流~~很熱心~~ 2010-08-08 21:35:56
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氯化鈣轉(zhuǎn)化恐怕是最大的問題吧。我沒有看到文獻上說用氯化鈣方法轉(zhuǎn)化DNA片段的，盡量聯(lián)系下用電轉(zhuǎn)吧。還有就是DNA片段的濃度和感受態(tài)細(xì)胞的濃度在做高些吧。DNA我們最后都是濃縮到500~1000ng/ul,電轉(zhuǎn)時100ul的細(xì)胞加1ul片段。 1、我用的酶是fermentas的pfu酶；我沒有用DpnI降解模版質(zhì)粒；但事后我用堿裂法提取陽性克隆的質(zhì)粒，并沒有提出來； 這一步我們也不降解，pcr結(jié)束后切膠回收，純化濃縮。 2、W1485的araBAD基因沒有失活，所以我用的L－ara濃度是10mM； 這一步?jīng)]什么為問題，可以一開始就加，也可以O(shè)D在0.1~0.2之間加，最后可以多養(yǎng)會，我們一般養(yǎng)到OD0.7左右。 3、因為實驗室不具備電轉(zhuǎn)條件，所以只能用化學(xué)轉(zhuǎn)化； 這個化學(xué)轉(zhuǎn)化恐怕不行吧 4、40ppm的卡納霉素就是40ug/mL；但是我用的氯霉素是8ug/mL； 氯霉素太低了些 5、因為菌落PCR擴增不出來，所以才用基因組DNA擴增，但是我像上位仁兄的建議那樣，我做了陰性和陽性對照實驗了…… |
6樓2010-04-12 08:38:55
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