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【原創(chuàng)】水稻原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化瞬時表達 已有5人參與
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Rice protoplast preparation Rice protoplast preparation Our protoplast isolation protocol was based on the protocol for maize protoplasts provided online by J. Sheen’s laboratory http://genetics.mgh.harvard.edu/sheenweb with several changes. 1. 將37℃萌發(fā)的水稻種子播種在PCR板上與28℃暗中培養(yǎng)7-9天 Rice seeds were grown in plastic pots filled with soil either in the light or in the dark at 28℃. Between 7 and 14 days post germination, plants were~10-20cm tall. 2. 純化轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒20ul,每ul要達1ug。 3. 配制10-15ml酶液和40ml 0.6M Mannitol平衡液（甘露醇，現(xiàn)配）等，最好用滅過菌的三角瓶，檢查其他溶液，若出現(xiàn)沉淀則需重配。 4. 取幼苗，把根切下后浸在0.6M Mannitol中，用0.6M Mannitol浸濕切口，用吉列刀片切，越小越好，一旦刀片不鋒利就換，切到葉片處停止，換新的切，將切下的放入0.6M Mannitol中，平衡10min。用100目疊200目篩子過濾后（目的是過濾Mannitol，只留組織），將切碎的組織投入酶液中，抽真空5min（可不抽），在250ml的三角瓶中用牛皮紙或鋁箔刨包裹，搖床上以80轉(zhuǎn)/min在28℃搖4hr-5hr（黑暗）。[250 ml flask for 10-20ml enzyme solution]。此時配W5和Mmg，搖后液體會變略渾濁。 5. 經(jīng)200目和100目篩子過濾（任何一種均可），用剪口槍頭吸，裝入10ml tube中�？扇∫稽c做鏡檢，40×和20×下能看到20-40個就可以，圓的有大有小。 6. 提籃離心85g， 3-5min（離完后可見明顯的渾濁沉淀在管底），（剪口槍頭吸�。壣锨�，慢慢沿管壁加入4ml W5溶液，輕輕用剪口槍頭吸打，再離心600rpm，3-5min（在50ml tube中離心） 7. 棄上清，加入預冷的Mmg溶液4ml（加管壁上），600rpm，3-5min，棄上清重加入2ml Mmg溶液，充分懸浮，冰浴30min。 8. 600rpm，3-5min離心沉淀原生質(zhì)體，（剪口槍頭吸�。壣锨�，補Mmg至每質(zhì)粒100ul左右。 9. 在2ml tube中，每100ul原生質(zhì)體，依次加入20ul質(zhì)粒，和120ul 40%PEG，充分混勻（不用槍混），室溫20min。 10. 加入1ml W5溶液，混勻，輕洗，最后加10ml W5。 11. 轉(zhuǎn)移到六孔培養(yǎng)板，用錫紙包，28℃暗培養(yǎng)20-24hrs，可見白色小塊，為死的原生質(zhì)體，如果多的話要過濾。 12. 600rpm，5min，提籃離心，用剪口槍頭收集原生質(zhì)體，即可觀察。（離心后看見沉淀，用槍將上清吸出，只留一點液體，有白色絮狀）。 **凡涉及原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)移和PEG的添加時，均須用剪口的并經(jīng)火焰輕燒過的槍頭。 Enzyme solution 現(xiàn)用現(xiàn)配，可頭天晚上配好后放入冰箱 (0.6M Mannitol, 100mM MES母液(pH5.7), 1.5%Cellulase RS, 0.75% Macerozyme, 0.1%BSA, 1mM CaCl2, 5mM β-mercaptoethanol and 50 ug/ml carbenicillin（可抑制細菌生長）) 55℃（讓酶可溶，加酶后會變棕色），10min，然后自然冷卻后，可用 W5 solution(ddh2o配，放時間太長易長菌) KOH調(diào)pH 154mM NaCl, 125 mM CaCl2, 5 mM KCl, 2 mM MES(pH5.7) Mmg solution(ddh2o配) 0.6M Mannitol, 15 mM MgCl2, 4 mM MES(pH5.7) 40%PEG （分裝，25℃保管）KOH調(diào)pH 偏堿性好，7.5-8.0之間 0.6M Mannitol, 100 mM CaCl2, 40% v/v PEG 335 W5 solution 100ml 154 mM NaCl 0.9g 125 mM CaCl2 1.84g 5 mM KCl 5ml 100mM(母液) 2 mM MES 2ml 100mM(母液) 配好后加20ul CN(250濃度) Mmg solution 10ml 0.6M Mannitol 1.093g 15 mM MgCl2 1.5ml 100mM(母液) 4 mM MES 400ul 100mM(母液) 100 mM MES 100ml （滅菌后4℃保存） 1.95g 加h2o至100ml， pH5.7（KOH調(diào)） Rice protoplast preparation （所有試劑進口） 100 mM MES 100ml （滅菌后4℃保存） 1.95g 加h2o至100ml， pH5.7（KOH調(diào)） 2.1326g（•2h2o） 100 mM CaCl2 MW:111(無水) 1.11g 加h2o至100ml 1.4702g（•2h2o） 100 mM KCl MW:74.55(無水) 0.746g加h2o至100ml 100 mM MgCl2 MW: 95 95 g加h2o至100ml 0.6M Mannitol 40ml 4.37 g加h2o至40ml Mannitol MV:182.17 Cellulose RS Macerozyme BSA Carbenicillin MgCl2 NaCl CaCl2 PEG3350 50ml 滅菌三角瓶 藍吉列刀片 篩子 滅菌平皿 滅菌10ml tubes 滅菌2 ml tubes 六孔培養(yǎng)板 滅菌1ml 槍頭剪口，燒過 200ul 12個以上 W5 solution 100ml 154 mM NaCl 0.9g 125 mM CaCl2 1.84g 2.44g（2H2o） 5 mM KCl 5ml 100mM(母液) 2 mM MES 2ml 100mM(母液) CN 20ul Add h2o to 100ml Mmg solution 10ml 0.6M Mannitol 1.093g 15 mM MgCl2 1.5ml 100mM(母液) 4 mM MES 400ul 100mM(母液) Add h2o to 10ml 40%PEG 10ml 0.6M Mannitol 1.093g 100 mM CaCl2•2h2o 0.147g 40%PEG3350 4g Add h2o to 10ml KOH調(diào)pH 7.5-8.0分裝入1.5ml tubes -20℃保存 Enzyme solution 10-15ml 0.6M Mannitol 1.093g 10 mM MES （pH5.7） 1ml 100mM(母液) 1.5% Cellulose RS 0.15g 0.75% Macerozyme 0.075g 0.1%BSA 0.01g 1 mM CaCl2 0.1ml 100mM(母液) 0.25g/ml Carbenicillin 2ul Add h2o to 10ml 55℃ 10min 自然冷卻 變棕色 現(xiàn)配或提前配放4℃過夜 |
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