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泡泡9706銀蟲 (小有名氣)
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[交流]
【求助/交流】離子交換層析 已有4人參與
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| 我異源表達(dá)的目的蛋白等電點(diǎn)預(yù)測(cè)為9，粗酶液上陰離子交換柱，用ph 7.5的緩沖液，目的蛋白在穿透峰里。我想換用陽離子交換柱，可是用了20mM ph 5的醋酸緩沖液，ph 7的磷酸緩沖液，所有的蛋白都不掛柱，都在穿透峰里，試了好多柱子，強(qiáng)陽的，弱陽的，預(yù)裝的，自己裝的，都是這個(gè)情況，想請(qǐng)教高手，會(huì)是什么原因呢？ |
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泡泡9706
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5樓2010-04-29 14:17:05
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泡泡9706(金幣+1): 2010-04-29 14:15
scelab(金幣+3):歡迎多來交流！:tiger06: 2010-04-30 15:52
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偶的蛋白預(yù)測(cè)PI為8.8-9.0，最初的時(shí)候高聚不掛柱，后來想辦法解聚了。在pH6.5的MES中掛在Resource S柱上，純化的效果還是不錯(cuò)的。 考慮你的蛋白是不是也是高聚狀態(tài)，如果是的話不掛柱也正常了。有幾個(gè)半胱氨酸？有的話要加入β-巰基乙醇或者DTT，防止形成錯(cuò)誤的二硫鍵；是否結(jié)合底物會(huì)有較強(qiáng)的構(gòu)象改變，如果是可以考慮加入底物，穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。 多對(duì)你蛋白的性質(zhì)進(jìn)行了解，然后嘗試。 有填料建議使用小柱子做預(yù)實(shí)驗(yàn)。 |
3樓2010-04-29 12:15:32
泡泡9706
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4樓2010-04-29 14:13:48
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