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陽(yáng)光金魚(yú)唐金蟲(chóng) (著名寫(xiě)手)
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[交流]
【求助/交流】假陽(yáng)性是什么原因造成的？ 已有7人參與
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| 藍(lán)白斑篩選，長(zhǎng)出了藍(lán)斑和白斑，我挑白斑擴(kuò)大培養(yǎng)，然后以菌液為模板，用目的片段的引物做PCR，卻得不到我要的目的片段，是目的片段與載體沒(méi)連接上嗎？還是沒(méi)轉(zhuǎn)化成功？是假陽(yáng)性嗎？因?yàn)闄z測(cè)不出來(lái)，我目前也沒(méi)法送去測(cè)序，急�。�！還有，我后來(lái)重復(fù)做了多次，都長(zhǎng)不出任何東西了，是不是載體放過(guò)期了，還是T4連接酶失效了？試劑盒從買回來(lái)到現(xiàn)在超過(guò)半年了，第一次動(dòng)用是在4個(gè)月前，中間又用過(guò)幾次。哪位大蝦能夠答疑，在下將感激涕零！ |
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yujiaping1
木蟲(chóng) (著名寫(xiě)手)
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lstt09nk(金幣+2):熱心蟲(chóng)友~~ 2010-04-29 15:29
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lstt09nk(金幣+2):熱心蟲(chóng)友~~ 2010-04-29 15:29
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第一個(gè)問(wèn)題，你挑的白斑是含有插入片段載體的菌，這是毋庸置疑的，因?yàn)槿绻d體自連，那么就是藍(lán)斑，如果沒(méi)有載體，菌就沒(méi)有抗性，無(wú)法生長(zhǎng)，所以一定是含有插入片段載體的菌，但是這個(gè)插入片段不一定是目的片段，造成這種現(xiàn)象的原因很多，PCR產(chǎn)物不純，連接上引物片段，或者存在質(zhì)粒污染等，針對(duì)這種現(xiàn)象，一般就是多挑白斑，篩選到陽(yáng)性克隆。 第二個(gè)問(wèn)題，我認(rèn)為你的載體半年肯定不會(huì)有問(wèn)題，而且之前你成功的獲得了陽(yáng)性克隆，現(xiàn)在建議你做一下試劑盒提供的對(duì)照，如果沒(méi)有問(wèn)題，就說(shuō)明的目的片段的濃度和載體的配比或者是目的片段太長(zhǎng)，連接失敗造成的。 但就目前的情況看，你連藍(lán)斑都看不見(jiàn)了，估計(jì)你做對(duì)照也不一定能行，所以很有可能是你的培養(yǎng)基或者抗性之類的出問(wèn)題了，好好檢查一下 |
3樓2010-04-29 15:02:53
fungixx
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2樓2010-04-29 14:00:08
shengwufenzi
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4樓2010-04-29 15:54:44
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lstt09nk(金幣+2):感謝交流~~ 2010-04-29 16:26
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lstt09nk(金幣+2):感謝交流~~ 2010-04-29 16:26
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第一個(gè)問(wèn)題解決如下：你可以在菌斑長(zhǎng)出來(lái)之后，放在4度至少4小時(shí)，這樣一些本來(lái)是白斑的假陽(yáng)性就會(huì)變成藍(lán)斑。 第二個(gè)問(wèn)題：可能的情況很多，首先懷疑試劑盒出問(wèn)題是對(duì)的。因?yàn)榉磸?fù)凍融會(huì)使試劑盒失效。另外感受態(tài)也是很重要的一個(gè)環(huán)節(jié)，感受態(tài)制備不好，所以就不會(huì)長(zhǎng)任何東西。 |
5樓2010-04-29 16:22:17
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