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陽光金魚唐金蟲 (著名寫手)
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[交流]
【求助/交流】假陽性是什么原因造成的？ 已有7人參與
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| 藍(lán)白斑篩選，長出了藍(lán)斑和白斑，我挑白斑擴(kuò)大培養(yǎng)，然后以菌液為模板，用目的片段的引物做PCR，卻得不到我要的目的片段，是目的片段與載體沒連接上嗎？還是沒轉(zhuǎn)化成功？是假陽性嗎？因?yàn)闄z測不出來，我目前也沒法送去測序，急�。�！還有，我后來重復(fù)做了多次，都長不出任何東西了，是不是載體放過期了，還是T4連接酶失效了？試劑盒從買回來到現(xiàn)在超過半年了，第一次動用是在4個(gè)月前，中間又用過幾次。哪位大蝦能夠答疑，在下將感激涕零！ |
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shengwufenzi
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4樓2010-04-29 15:54:44
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2樓2010-04-29 14:00:08
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小木蟲(金幣+0.5):給個(gè)紅包，謝謝回帖交流
lstt09nk(金幣+2):熱心蟲友~~ 2010-04-29 15:29
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lstt09nk(金幣+2):熱心蟲友~~ 2010-04-29 15:29
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第一個(gè)問題，你挑的白斑是含有插入片段載體的菌，這是毋庸置疑的，因?yàn)槿绻d體自連，那么就是藍(lán)斑，如果沒有載體，菌就沒有抗性，無法生長，所以一定是含有插入片段載體的菌，但是這個(gè)插入片段不一定是目的片段，造成這種現(xiàn)象的原因很多，PCR產(chǎn)物不純，連接上引物片段，或者存在質(zhì)粒污染等，針對這種現(xiàn)象，一般就是多挑白斑，篩選到陽性克隆。 第二個(gè)問題，我認(rèn)為你的載體半年肯定不會有問題，而且之前你成功的獲得了陽性克隆，現(xiàn)在建議你做一下試劑盒提供的對照，如果沒有問題，就說明的目的片段的濃度和載體的配比或者是目的片段太長，連接失敗造成的。 但就目前的情況看，你連藍(lán)斑都看不見了，估計(jì)你做對照也不一定能行，所以很有可能是你的培養(yǎng)基或者抗性之類的出問題了，好好檢查一下 |
3樓2010-04-29 15:02:53
gaiyf
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5樓2010-04-29 16:22:17
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