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pidou213木蟲 (正式寫手)
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[交流]
【求助/交流】RACE 引物 已有4人參與
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請(qǐng)問做RACE的引物用什么純化比較好？ HAP? PAGE?? 還是其他？？ 突然想到的，不知道怎么選擇 |
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木蟲 (職業(yè)作家)
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2樓2010-04-29 18:38:40
pidou213
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為什么引物在某些時(shí)候需要純化 DNA合成結(jié)束后，完整的DNA鏈在堿性溶液（如氫氧化銨）的作用下從固相支持物中解理下來。解離下來的溶液中既包含了完整的所需寡核苷酸，同時(shí)也包含了在合成過程中失敗的DNA鏈（錯(cuò)誤序列）。比如合成一個(gè)20個(gè)堿基寡核苷酸，其洗脫溶液中也包含了19，18，17個(gè)堿基等合成時(shí)錯(cuò)誤的序列。錯(cuò)誤序列的數(shù)量取決于合成效率。在許多實(shí)驗(yàn)如PCR中，這些錯(cuò)誤的序列會(huì)與正確的全長(zhǎng)產(chǎn)物競(jìng)爭(zhēng)，因此在使用之前需要將其去除以提高下游應(yīng)用的成功率。 不同應(yīng)用對(duì)純化方式的選擇 應(yīng)用領(lǐng)域 建議的純化方式 AFLPTM 分析 脫鹽引物在限制性片段擴(kuò)增多態(tài)性研究（ARFP）中可被成功應(yīng)用 反義研究 HPLC純化的引物在相關(guān)文獻(xiàn)中引用最多 循環(huán)測(cè)序 脫鹽純化的引物已經(jīng)足夠 文庫構(gòu)建中的第一鏈cDNA合成 用于文庫構(gòu)建中第一鏈合成的cDNA通常在其5’端有限制性內(nèi)切酶克隆位點(diǎn)，因此最好用全長(zhǎng)的，通過Cartridge、HPLC或PAGE純化的引物 熒光測(cè)序 四種純化級(jí)別的引物都可成功應(yīng)用 凝膠遷移實(shí)驗(yàn) 建議使用Cartridge、HPLC和PAGE純化的引物進(jìn)行凝膠遷移率實(shí)驗(yàn) GeneTrapper篩選 建議使用PAGE純化引物。如果購買了脫鹽引物，可以使用PAGE純化說明書對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步純化。在GeneTrapper系統(tǒng)中的加尾反應(yīng)時(shí)，引物需要事先經(jīng)過酚抽提和乙醇沉淀。 恒溫測(cè)序 脫鹽引物已經(jīng)足夠，Cartridge、HPLC和PAGE純化引物也可以。 微陣列 標(biāo)準(zhǔn)脫鹽引物已經(jīng)足夠 PCR 對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)PCR，脫鹽引物即可正常使用，其它三種純度更高的方式也可以 5’端序列較為重要的PCR（例如限制性酶切位點(diǎn)，RNA聚合酶啟動(dòng)子） 為達(dá)到最高效率，Cartridge、，HPLC和PAGE純化的引物是最好的選擇。因?yàn)橐锖铣墒菑?’端到5’端，不完整的寡核苷酸的會(huì)從5’端缺失。在這些應(yīng)用中使用5’端序列完整的全長(zhǎng)序列是很重要的，否則缺失5’端部分序列的一組PCR產(chǎn)物將被合成 克隆接頭產(chǎn)物 全長(zhǎng)引物最適合有效的克隆，利用Cartridge、HPLC或PAGE純化方式可得到合適的引物。對(duì)大于60個(gè)堿基的引物，PAGE純化方式是最好的 位點(diǎn)特異性突變 一定要使用通過Cartridge、HPLC和PAGE純化得到的全長(zhǎng)引物，才可能得到最高比例的突變體克隆（尤其是預(yù)突變位點(diǎn)在5’端附近時(shí)）。采用脫鹽引物也可以得到想要的突變。然而，一些野生型親本載體有可能會(huì)覆蓋掉這些突變。 |
3樓2010-04-29 18:49:25
cato8163
銀蟲 (正式寫手)
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4樓2010-04-29 21:42:15
miya173
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5樓2010-04-30 09:15:35
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