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happy8506新蟲 (初入文壇)
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[交流]
【求助/交流】DNase 處理 RNA 的具體步驟（不用試劑盒） 已有4人參與
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| 請(qǐng)教一下用DNase 處理 RNA ，除去DNA的詳細(xì)步驟，最好是不用試劑盒的。謝謝！ |
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happy8506
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除去 RNA 中的基因組 DNA 1. 在微量離心管中配制下列反應(yīng)液，全量 50 μl。 全 RNA 20～50 μg 10×DNase I Buffer 5 μl DNase I（RNase-free，5 U/μl） 2 μl RNase Inhibitor（40 U/μl） 0.5 μl DEPC H2O up to 50 μl 2. 37℃反應(yīng) 20～30 分鐘。 3. 使用以下兩種方法使 DNase I 失活。 A．熱處理 （1）加入 2.5 μl 0.5 M EDTA 80℃ 2 min。 （2）用 RNase Free dH2O定容至 100 μl。 B．苯酚/氯仿抽提 （1）用 50 μl RNase Free dH2O 定容至 100 μl 后加入等體積的苯酚/氯仿/異戊醇（25：24：1） 混勻。 （2）室溫，13,500 rpm 5 min 離心，取上清。 （3）加入等體積的氯仿/異戊醇（24：1）混勻。 （4）室溫，13,500 rpm 5 min 離心，取上清。 4. 加入 10 μl 3 M 醋酸鈉，250 μl 冷乙醇，冰上放置 10 min。 5. 4℃，13,500 rpm 15 min 離心，棄上清。 6. 加入 70%冷乙醇洗凈，4℃，13,500 rpm 5 min 離心，棄上清。 7. 沉淀干燥。 8. 用適量的 RNase Free dH2O溶解后，進(jìn)行Agarose 電泳確認(rèn)是否除去基因組 DNA。 這是我新查到的，應(yīng)該可以吧？ |
7樓2010-05-20 11:48:27
holyala
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小木蟲(金幣+0.5):給個(gè)紅包，謝謝回帖交流
lstt09nk(金幣+3):歡迎多多交流~~ 2010-05-19 18:52:29
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lstt09nk(金幣+3):歡迎多多交流~~ 2010-05-19 18:52:29
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1) 取10μgRNA樣品置于RNase–free的EP管中，進(jìn)行DNA消化。一般采用20μL體系。 RNA 10 μg DEPC水 n μL 10×DNase I Buffer 2 μL DNase I 2 μL Total volume 20 μL 2）37 ℃，反應(yīng)10min。 3）加入2μL 1mM EDTA，75 ℃變性10min，冰上冷卻。 4）補(bǔ)水至100μL（78μL DEPC–H2O），加入10μL 3M NaAC，2μL糖原，混勻后加入2.5倍體積的無水乙醇，再次混勻，-80 ℃靜置30min沉淀RNA，13000 rpm 4 ℃離心20min。70%乙醇（DEPC–H2O配制）洗滌并13000 rpm離心5min。稍微晾干后用DEPC–水溶解沉淀。 |
2樓2010-05-19 17:25:04
zhwenxing
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3樓2010-05-19 17:49:12
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4樓2010-05-19 18:15:03
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