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guojing0000木蟲 (小有名氣)
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[交流]
【求助/交流】緊急求助關(guān)于單細(xì)胞凝膠電泳實(shí)驗(yàn) 已有11人參與
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我最近在做彗星實(shí)驗(yàn)，但是很奇怪的是實(shí)驗(yàn)過程中不知道存在什么問題，跑完電泳后就看不到細(xì)胞了，視野是一片漆黑啊，嗚嗚嗚，很傷心，希望大家給我找找原因。 具體的實(shí)驗(yàn)方法如下： 2.1電泳膠板的制作 移液槍吸取10μL 1%正常熔點(diǎn)瓊脂糖，至4℃冷卻。待膠凝固（15min）后取出，置于冰上面。然后吸取150μL0. 5％正常熔點(diǎn)瓊脂糖，待膠稍微凝固加上潔凈的蓋玻片，至至4℃冷卻。待膠凝固（15min）后取出。之后用手指肚緩慢滑去蓋玻片。吸取25μL細(xì)胞懸浮液與75μL低熔點(diǎn)瓊脂糖混和，迅速將細(xì)胞混合液滴到第一層膠上，加蓋玻片讓其均勻鋪開，置4℃15min，使瓊脂固化。 2.2細(xì)胞裂解 移開蓋玻片，將載玻片浸入新配制的4℃裂解液中，在4℃冰箱中放置至少1h，但時(shí)間不能過長(zhǎng)，長(zhǎng)時(shí)間的裂解可能導(dǎo)致裂解液沉淀。 2.3 DNA解旋 輕輕移去蓋玻片后將載玻片水平并列置于電泳槽陽(yáng)極端，電泳槽中盛有新配制堿性電泳緩沖液，約覆過載玻片2.5mm，放置30min。 2.4電泳 調(diào)整電泳槽中緩沖液面高度，使電泳儀的電壓為25V(恒壓)，電流為300mA，電泳20min。 2.5中和、染色 電泳結(jié)束后取出玻片用蒸餾水沖洗3次，并用濾紙吸去多余的水分，放小瓷盤，沿器壁加入0.4mol•L-1Tris-HCl(pH=7.5)緩沖液，中和3次，每次5分鐘，中間更換中和液。 2.6觀察和分析： 各組載玻片加入染色劑染色5min后，用熒光顯微鏡觀察，用隨機(jī)軟件在自動(dòng)曝光條件下拍照獲取彗星圖像后，用CASP軟件分析測(cè)量DNA遷移的各種參數(shù)。 3． 實(shí)驗(yàn)試劑配制方法 試劑的配置： 正常熔點(diǎn)的瓊脂（normal melting agarose）；低熔點(diǎn)的瓊脂（low melting agarose）；Tris；肌氨酸鈉（Sodium sarcosinate）；Triton X-100；DMSO（dimethyl sulfoxide；二甲基亞砜）； EB（ethidium bromide）；NaCl；Na2EDTA；EDTA；NaOH；KCl；Na2HPO4；KH2PO4；乙醇 1%正常熔點(diǎn)的瓊脂（無Ca2+、Mg2+的PBS配制）： 配 10ml 需瓊脂為：0.1g，稱量完放入水浴鍋，使水浴鍋溫度不斷上升至95攝氏度，觀察到澄清透明時(shí)方可。 0.5%正常熔點(diǎn)的瓊脂（無Ca2+、Mg2+的PBS配制）： 配 5ml 需瓊脂為：0.05g，稱量完放入水浴鍋，使水浴鍋溫度不斷上升至95攝氏度，觀察到澄清透明時(shí)方可。 0.7%低熔點(diǎn)的瓊脂（無Ca2+、Mg2+的PBS配制）： 配 10ml 需瓊脂為：0.7g，稱量完放入水浴鍋，使水浴鍋溫度不斷上升至37攝氏度，觀察到澄清透明時(shí)方可。 細(xì)胞裂解液（4℃）： 2.5M NaCl；100mM Na2EDTA；10mM Tris；調(diào)pH至10；1%肌氨酸鈉；臨用前加1% Triton X-100，10% DMSO 配500ml 需：NaCl 73.05g；Na2EDTA 18.61g；Tris 0.61g；肌氨酸鈉5g；Triton X-100 5ml；DMSO 50ml，NaOH 4g 配制方法：先用300ml滅菌水溶解NaOH 4g，然后加入肌氨酸鈉，用磁力攪拌加熱溶解，然后再加入其它物質(zhì)。臨用前1小時(shí)加入1% Triton X-100，10% DMSO，磁力攪拌無固體后，放入4攝氏度冰箱。 電泳緩沖液： 1mM Na2EDTA和300mM NaOH，調(diào)pH＞13，現(xiàn)用現(xiàn)配。 pH 7.5，0.4M Tris： 配100ml需Tris為：4.8456g，加盡量少的水溶解，用HCl調(diào)節(jié)pH=7.5 碘化丙錠PI水溶液：2mg/l EB染色劑（4℃暗處保存） 需要補(bǔ)充一句的是，我的PI是去年1月份配置的，放置到現(xiàn)在采用，請(qǐng)問可以嗎？配置時(shí)的濃度是100mg/l的，現(xiàn)在每次使用前稀釋。 希望大家知無不言，言無不盡啊，我實(shí)在是找不到原因了啊 謝謝各位大蝦啦！ |
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