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[交流]
【求助/交流】求助：酵母感受態(tài)細(xì)胞的制備 已有4人參與
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老板要求至少要用5種化學(xué)法制備畢赤酵母感受態(tài)細(xì)胞及轉(zhuǎn)化，在這里跪求各位蟲友的幫助！ 急求：酵母化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化方法，，注意要的是化學(xué)法，電轉(zhuǎn)化法不需要！希望大家?guī)椭≈x謝！ [ Last edited by 527702467 on 2010-6-2 at 10:28 ] |
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qutao1720
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2樓2010-06-02 20:38:45
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3樓2010-06-02 22:30:33
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527702467(金幣+1):謝謝參與
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1、畢氏酵母氯化鋰轉(zhuǎn)化法 （1）試劑 1M LiCl（用去離子蒸餾水配制，濾膜過濾除菌；必要時用消毒去離子水稀釋） 50% PEG3350（Sigma P3640 用去離子蒸餾水配制，濾膜過濾除菌，用較緊的蓋子的瓶子分裝） 2mg/ml salmon sperm DNA / TE（10mM Tris-Cl, pH8.0, 1.0mM EDTA）-20℃保存 注：醋酸鋰對畢氏酵母無效，僅氯化鋰有效；PEG3350可屏蔽高濃度LiCl的毒害作用； （2）感受態(tài)畢氏酵母的制備 接種Pachia pastoris到50ml YPD培養(yǎng)基中，30℃搖菌過夜（約24～28h）培養(yǎng)到OD值為0.8～1.0（約108 Cells/ml）； 收獲細(xì)胞，用25ml無菌水洗滌一次，室溫下1500g離心10min； 重懸細(xì)胞于1ml 100mM LiCl溶液中，將懸液轉(zhuǎn)入1.5ml離心管； 離心機最大速度離心15秒沉淀菌體，重懸菌體于400ul 100mM LiCl溶液中； 按50ul/管分裝，立即進(jìn)行轉(zhuǎn)化； 注：不要將感受態(tài)酵母菌冰�。� （3）畢氏酵母的轉(zhuǎn)化 煮沸1ml鮭魚精DNA 5min，迅速冰浴以制備單鏈擔(dān)體DNA； 將感受態(tài)酵母菌離心，以Tips去除殘余的LiCl溶液； 對于每一個轉(zhuǎn)化，按以下順序加入： 50% PEG3350 240ul 1M LiCl 36ul 2mg/ml 單鏈Salmon sperm DNA 25ul 5～10ug/50ul H2O 質(zhì)粒DNA 50ul 劇烈旋渦混勻直至沉淀菌體完全分布均勻（約1min）； 30℃水浴孵育30min； 42℃水浴熱休克20～25min; 6000～8000rpm離心收集酵母菌體； 重懸酵母于1ml YPD培養(yǎng)基，30℃搖床孵育； 1～4h后，取25～100ul菌液鋪選擇性培養(yǎng)基平板，于30℃培養(yǎng)2～3天鑒定； 2、畢氏酵母PEG1000轉(zhuǎn)化法 （1）試劑 緩沖液A：1.0M Sorbitol，10mM Bicine，pH8.35（sigma）,3%（v/v）ethylene glycol 緩沖液B：40%（w/v）PEG1000（sigma），0.2M Bicine，pH8.35 緩沖液C：0.15M NaCl，10mM Bicine，pH8.35 未污染的新鮮、試劑級DMSO，-70℃保存 注： 緩沖液A、B、C均用濾膜過濾，-20℃保存; 將DNA直接加在凍結(jié)的酵母細(xì)胞上是本實驗的關(guān)鍵之處（即使在冰上解凍的待轉(zhuǎn)化細(xì)胞，其攝取外源DNA的能力也在解凍過程中迅速下降；如進(jìn)行多樣品的轉(zhuǎn)化，建議按6樣品/組進(jìn)行）; （2）待轉(zhuǎn)化畢氏酵母的制備 接種環(huán)接種Pachia pastoris于YPD平板，30℃培養(yǎng)2d; 挑取單克隆酵母菌株于10mlYPD培養(yǎng)基中，30℃振蕩培養(yǎng)過夜； 取步驟2中小量菌液接種到100mlYPD培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，待其OD值從0.1升到0.5～0.8； 室溫下3000g離心收集酵母菌體，50ml緩沖液A洗滌一次； 重懸菌體于4ml緩沖液A中，按0.2ml/管分裝于1.5ml的離心管中，每管加入11ulDMSO，混合后迅速于液氮中冷凍， -70℃保存 （3）畢氏酵母的轉(zhuǎn)化 將約50ug線性化質(zhì)粒DNA溶于20ul TE或水中，直接加于凍結(jié)的酵母細(xì)胞中；加入擔(dān)體DNA（40ug變性超聲線性化鮭魚精DNA）以獲得最大轉(zhuǎn)化率； 37℃水浴孵育5min，中間混合樣品1～2次； 取出離心管，加入1.5ml緩沖液B，徹底混勻； 30℃水浴孵育1h； 室溫下2000g離心10min，去除上清液，菌體沉淀重懸于1.5ml緩沖液C中； 離心樣品，去除上清液，輕微操作將樣品重懸于0.2ml緩沖液C中； 將所有轉(zhuǎn)化液鋪于選擇性平板，于30℃孵育3～4天后，鑒定； 3、畢氏酵母電轉(zhuǎn)化法 （1）E.coli TOP10F’感受態(tài)細(xì)胞的制備 取10ul TOP10F’菌液，接種于200ml LB液體培養(yǎng)基中活化培養(yǎng)，37℃，200 rpm，16～18小時。取100ul菌液接種于200ml液體LB培養(yǎng)基中。 37℃，200 rpm，培養(yǎng)16～18小時。 滅菌500 ml離心管，4℃，4000 rpm，20 min。得菌體沉淀。棄上清，菌體用10％甘油重懸并洗滌。重復(fù)洗滌3次。 第三次離心后，棄絕大部分上清，留下約1ml 液體用于重懸菌體。 從制得得感受態(tài)細(xì)胞中，取200ul于滅菌EP管中，加入連接反應(yīng)產(chǎn)物5ul，混勻，不要產(chǎn)生氣泡，在冰上放置5min。 將混勻后得200ul菌液移入電擊杯中。 使用電擊穿孔儀進(jìn)行轉(zhuǎn)化，設(shè)置為電壓 2500 V，時間 5 ms。 電擊后，往電擊杯中加入 800ul SOC培養(yǎng)基，沖洗出菌體，轉(zhuǎn)移至滅菌1.5 ml EP管中。37℃，150 rpm ，輕搖45～60 min。 取全部均勻涂布于含 Zeocin 25 ug/ml 的LLB－Zeocin平板上，正放，待涂布液不在流動，37℃ 培養(yǎng)12～16小時。 （2）線性化質(zhì)粒DNA對Pichia pastorisGS115的轉(zhuǎn)化 取新鮮制備的（或－70℃凍存的）感受態(tài)細(xì)胞置于冰浴中，使其完全解凍； 1）將100μl菌體移出至一新的無菌Eppendorf管中，加入5－20μg線性化質(zhì)粒（5～10μl），輕彈混勻，盡數(shù)吸出轉(zhuǎn)移到0.2cm型的電穿孔轉(zhuǎn)化杯中； 2) 轉(zhuǎn)化杯置于冰浴中5～10分鐘，保持低溫。 3) 電穿孔轉(zhuǎn)化電擊條件：電壓：1500V；電阻：400Ω；電容：25μF；脈沖時間：10mS；一次電擊。 4) 電擊后，馬上在電擊轉(zhuǎn)化杯中加入1ml 4℃預(yù)冷的1M的山梨醇溶液，用微量移液槍吹打均勻，置于冰浴中； 5) 取30℃烘至表面半干的MD培養(yǎng)基平板，在超凈工作臺上無菌操作涂布平板，400μl/板 |
4樓2010-06-08 20:06:29
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