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global.wun銀蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
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電轉(zhuǎn)化注意事項(xiàng)
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一、 制備感受態(tài)的菌液收集時(shí)間： 1、準(zhǔn)確測(cè)定OD值：OD在1.2～1.5之間。 1） 為了準(zhǔn)確測(cè)定OD值，建議將菌液稀釋不同濃度測(cè)定（1、2、4、8、16倍稀釋?zhuān)雌銸D值是否呈線性關(guān)系）。每個(gè)倍數(shù)做3－5個(gè)重復(fù)，應(yīng)該可以大致推斷OD值是否準(zhǔn)確！菌液看上去渾濁，但OD值不高，很可能OD稀釋倍數(shù)不夠！ 2） OD值是否測(cè)準(zhǔn)也可以這樣估算：OD600為40左右時(shí)，菌體濕重（6000rpm離心5min）約0.95g/10ml。高密度發(fā)酵時(shí)菌體濕重將相應(yīng)下降。 2、75ml的菌，經(jīng)18h左右的培養(yǎng)，最后sorbital洗滌完畢后，50ml離心管里所剩菌體特別濃，需要1ml sorbitol才可溶解為糊狀。正常培養(yǎng)的OD在1.2～1.5之間的500ml菌液，收集的感受態(tài)也用1ml稀釋的，沒(méi)那么粘稠�？梢钥纯唇档团囵B(yǎng)溫度（27攝氏度）或縮短培養(yǎng)時(shí)間（12h）。 3、甚至不用轉(zhuǎn)接,直接挑單克隆在50－100mlYPD中搖過(guò)夜，效果也很好 二、制備感受態(tài)的菌液量 如果只轉(zhuǎn)一個(gè)樣品，50ml就夠了，一般50ml的培養(yǎng)液如果OD值正常的話(huà)夠做10管感受態(tài)的，其他的按比例縮小。用大試管搖5ml菌液，然后取1ml毫升在1.5mlEP管中制感受態(tài)，每一步的離心時(shí)間30秒就行。整個(gè)流程時(shí)間短，制備好的感受態(tài)用來(lái)做轉(zhuǎn)化的效率很高。 山梨醇離心，洗滌的過(guò)程之后的重懸的時(shí)候注意濃度，不要過(guò)于粘稠和稀釋。 三、感受態(tài)的保存 感受態(tài)細(xì)胞做好后由于電轉(zhuǎn)化杯還沒(méi)有處理好等原因，在冰上放幾個(gè)小時(shí)再做可能有一定的影響，盡量馬上制備馬上轉(zhuǎn)化。如果感受態(tài)細(xì)胞要保存，不需要加甘油，一般80ul EP管分裝，-70 或 -80 攝氏度保存。 另附：酵母GS115點(diǎn)種分離純化 接種GS115于5ml YPD液體培養(yǎng)基，30℃，200rpm振蕩過(guò)夜，涂布 YPD平板，30℃培養(yǎng)48 小時(shí)，用 YNB基本培養(yǎng)基和含His的補(bǔ)充培養(yǎng)基作點(diǎn)種分離純化，挑選在補(bǔ)充培養(yǎng)基生上生長(zhǎng)而在基本培養(yǎng)基上不生長(zhǎng)的單菌落劃YPD平板，4℃保存。 四、電轉(zhuǎn)化注意點(diǎn)： 1、感受態(tài)做好后，最后一次吸出sorbital時(shí)，不是直接倒調(diào)的，而是用毛細(xì)管輕吸出來(lái)的，這樣可能使剩下的感受態(tài)純凈些。 2、最后用毛細(xì)管取出100ul出來(lái)，加入質(zhì)粒，混勻！（怕量不夠，吸得很多，電轉(zhuǎn)時(shí)效果反而不好。 ） 3、電轉(zhuǎn)杯清潔處理:一般先沖洗，洗凈；然后浸泡在75%的乙醇中；使用前我們都是放在超凈臺(tái)上，開(kāi)啟紫外，邊吹風(fēng)晾干，邊進(jìn)行紫外照射。電轉(zhuǎn)杯的新包裝或重復(fù)使用可能對(duì)轉(zhuǎn)化率有一定的影響。 4、電擊的時(shí)候，電壓數(shù)以及電擊時(shí)間可以摸索一下，適當(dāng)增加電壓或者延長(zhǎng)電擊時(shí)間都可以。電擊條件比如1.5kv，放電4.8～5.5ms。電擊所有過(guò)程都要盡量在冰上進(jìn)行，電擊時(shí)間可以減少一點(diǎn)，設(shè)置為5ms左右，電擊之后馬上加入預(yù)冷的山梨醇溶液，轉(zhuǎn)移至EP管，30度靜止培養(yǎng)1h。如果菌體懸液濃度比較大的時(shí)候，在制備感受態(tài)的時(shí)候要留心一下操作中的問(wèn)題了。 5、電擊之后，加入1ml的山梨醇，吸入1.5ml的ep管中，置于30度搖床低速培養(yǎng)1h，再涂板。 6、注意的是處理液中的DTT是在使用前加入，其它配好后于4度保存，DTT單獨(dú)于-20度保存，可配成100倍的貯備液。 7、轉(zhuǎn)化后1ml用sorbitol重懸的細(xì)胞懸液不能全部涂在一塊板子上，按標(biāo)準(zhǔn)程序制作的感受態(tài)一般3塊左右可能比較合適，以干燥后看見(jiàn)一薄層淡淡的白色為宜。轉(zhuǎn)化子會(huì)在白色的薄層上長(zhǎng)出圓韻、飽滿(mǎn)的大菌落的。 五、轉(zhuǎn)化試劑和培養(yǎng)基的正確準(zhǔn)備方法 1、MD板子提前幾天做好，放在冰箱里，涂板的時(shí)候吸收效果會(huì)好些。如果是新板子，可能吸收不是太好，板子上有些積層，反而不利于生長(zhǎng)。 2、YNB42度水浴一會(huì)，然后過(guò)濾除菌，YNB是加到培養(yǎng)基里面的，去離子水pH偏低，建議直接用蒸餾水就可以（關(guān)系不是太大）。 3、山梨醇，以及無(wú)菌去離子水均是冰凍，存放在4度冰箱中 4、一般用10ug以上質(zhì)粒用SalI酶切，然后直接加乙醇沉淀，70％乙醇洗一遍，約20ul ddH2O重溶。轉(zhuǎn)化效率一般大于100個(gè)克隆每ugDNA。有人用LiCl和DTT處理細(xì)胞，轉(zhuǎn)化效率很高，可以試試。建議你不要用膠回收kit，回收的DNA可能還有鹽，導(dǎo)致電擊時(shí)放電時(shí)間很短。 5個(gè)電轉(zhuǎn)化方案 方法一：高效 1.收集菌體 取1mlGS115過(guò)夜培養(yǎng)物(OD約6-10) 分裝到1.5ml EP管中，4℃、10000g 離心1min，棄上清，沉淀用無(wú)菌水(4℃)洗滌，同樣條件下離心，棄上清。 2.菌體處理 加入1ml處理液，室溫下放置20min。 處理液： 10mM LiAc 10mM DTT 0.6M sorbitol 10mM TrisHCl(pH7.5) 3.離心，棄上清，加入1ml 1M sorbitol ，離心，棄上清， 4.用1M sorbitol洗滌二次，到最終體積約為80μl.（菌體太多可適當(dāng)棄去部分） 5.加入10μl.經(jīng)過(guò)BglⅡ酶切處理的工程質(zhì)粒，混勻后轉(zhuǎn)入 電擊杯中，冰浴5min. 6.電轉(zhuǎn). 1.5kv，25μF，200Ω條件下進(jìn)行電轉(zhuǎn)。 7.電擊后立刻加入1mL 1M sorbitol，吸出后于30℃培養(yǎng)2h。 8.取一定量涂平板(YPDS + Zeocin，涂布的量分別為100、200微升，剩余的經(jīng)離心處理后全部涂在一個(gè)平板上) 有一點(diǎn)要注意的是處理液中的DTT是在使用前加入，其它配好后于4度保存，DTT單獨(dú)于-20度保存，可配成100倍的貯備液。 |
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銀蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
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方法二：按下面步驟轉(zhuǎn)化,開(kāi)始每個(gè)板子只長(zhǎng)了一二十菌落;小細(xì)節(jié)修改后,每個(gè)板長(zhǎng)了約100個(gè). 步驟如下： 1、目的DNA（pPIC9K)，經(jīng)電泳檢測(cè)已經(jīng)線性化（SalI酶切）； 2、DNA純化方法是經(jīng)酚仿－氯仿兩步抽提后，無(wú)水乙醇沉淀的，目測(cè)定量應(yīng)足夠； 3、GS115甘油菌經(jīng)新鮮平板復(fù)蘇后，5ML培養(yǎng)過(guò)夜，16h左右后，取菌1：100稀釋?zhuān)臃N于70ml菌液擴(kuò)大培養(yǎng)，14h后測(cè)得OD600約1.3左右。 4、將sorbital、水和菌液均冰浴； 5、菌液離心5min－100ml冰水洗滌－50ml冰水洗滌－4ml sorbital洗滌，然后溶解于300ul冰sorbital； 6、加入約5～10ug的DNA，槍吹勻，置0.2CM電轉(zhuǎn)杯靜置5min； 7、電擊，1,5KV. 8、立即加入1ml冰浴的sorbital，靜止10min。 9、取100ul轉(zhuǎn)化液，涂布10cm的MD平板。 做了一點(diǎn)修改每塊板子大概能長(zhǎng)100來(lái)個(gè)菌落（一般需要2天左右）： 1、菌液收集時(shí)間：以前可能是OD值測(cè)得不太準(zhǔn)確，我然后把菌液分別做了1、2、4、8、16倍稀釋?zhuān)雌銸D值是否呈線性關(guān)系。1、菌液測(cè)OD值時(shí)，建議將菌液稀釋不同濃度測(cè)定，這樣才準(zhǔn)確些。菌液看上去渾濁，但OD值不高，很可能就是你的OD稀釋倍數(shù)不夠！你分別稀釋2倍、4倍、8倍、10倍等，每個(gè)倍數(shù)做3－5個(gè)重復(fù)，應(yīng)該可以大致推斷OD值是否準(zhǔn)確！ 2、我開(kāi)始是先挑單克隆于5mlYPD中，過(guò)夜16h后，轉(zhuǎn)接于50ml YPD中，培養(yǎng)大概18個(gè)小時(shí)吧。OD值是否測(cè)準(zhǔn)可以這樣估算：OD600為40左右時(shí)，菌體濕重（6000rpm離心5min）約0.95g/10ml。高密度發(fā)酵時(shí)菌體濕重將相應(yīng)下降。[測(cè)OD，用什么作空白對(duì)照呢？菌體稀釋液，我一般使用PBS] 3、電擊條件等上面帖子上都有，1.5kv，放電4.8～5.5ms。 2、其它做法相同，就是感受態(tài)做好后，最后一次吸出sorbital時(shí)，不是直接倒調(diào)的，而是用毛細(xì)管輕吸出來(lái)的，這樣可能使剩下的感受態(tài)純凈些。 3、最后用毛細(xì)管取出100ul出來(lái)，加入質(zhì)粒，混勻�。ㄎ乙郧芭铝坎粔�，吸得很多，電轉(zhuǎn)時(shí)效果反而不好。 ） 4、MD板子提前幾天做好，放在冰箱里，涂板的時(shí)候吸收效果會(huì)好些。如果是新板子，可能吸收不是太好，板子上有些積層，反而不利于生長(zhǎng)。 5、你說(shuō)的YNB，我用的是成品，只需要直接配制。42度水浴一會(huì)，然后過(guò)濾除菌。我沒(méi)有加硫酸銨。YNB是加到培養(yǎng)基里面的，去離子水pH偏低哦，我建議直接用蒸餾水就可以了（關(guān)系不是太大）。 方法三：簡(jiǎn)便獨(dú)特 在篩選高表達(dá)菌種中，與大多數(shù)人和說(shuō)明書(shū)有區(qū)別(成功做出幾個(gè)基因): 每次轉(zhuǎn)化前，均用多種酶BlgII/salI/sacI同時(shí)切，轉(zhuǎn)化時(shí)，用GS115/KM71/KM71H同時(shí)轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化的條件也和大家一樣，即1.5/25/200,但是我用的是0.1的杯子，不是0.2的，轉(zhuǎn)化后涂MM及YPD+0.25G，長(zhǎng)出菌落后，即進(jìn)行大規(guī)模的表達(dá)試驗(yàn)，直接用YPD表達(dá)的，一般48h后即進(jìn)行大量的SDS-PAGE鑒定，鑒定時(shí)，樣品不用濃縮，直接上樣，看到目的帶后再做PCR，測(cè)序。 方法四：沒(méi)有轉(zhuǎn)化子（無(wú)aa的YNB和硫酸銨稱(chēng)好后，去離子水溶解，然后高壓滅菌） 1.挑取酵母單菌落，接種至含有50ml YPD培養(yǎng)基的三角瓶中，30℃、250-300rpm培養(yǎng)過(guò)夜約14h，OD600約1.3 2.菌液離心5min－50ml冰水洗滌－25ml冰水洗滌－2ml sorbital洗滌，然后溶解于200ul冰sorbital；兩管分裝，每管100ul 3.加入約5～10ug的線性化的DNA20ul，槍吹勻，置0.2CM電轉(zhuǎn)杯冰浴5min； 4.電擊，1,5KV.使用的是 Eppendorf 2510，用于轉(zhuǎn)化細(xì)菌及酵母。 5.立即加入1ml冰浴的sorbital，靜止1h。 將菌體懸液涂布于MD平板上，每300µl涂布一塊平板； 方法五: 和Invitrogen公司說(shuō)明書(shū)差不多的方法 X33菌株于100ml YPD搖到OD600約1.1-1.3，太高影響感受態(tài)效率 (1) 1500－1700g離心5min，將離心管倒置在吸水紙上輕輕控幾下，充分棄上清 (2) 加入100ml 冰浴的超純水ddH2O，可在振蕩器上振蕩混勻，可靜置3－5分鐘 (3) 離心，棄上清，再加100ml ddH2O洗一遍 (4) 離心，棄上清，加20ml 冰浴1M Sorbitol洗一遍 (5) 離心，棄上清，菌體置于冰浴中，加入約100－200ul Sorbitol混勻 加入Sorbitol量需自己調(diào)整，這時(shí)菌液很濃，只要能夠用200ul黃槍頭吸出來(lái)就可以了，一般共有約400－500ul，夠做幾管感受態(tài)了。 (7) 吸取100－150ul感受態(tài)到線性化的DNA中，用槍頭打勻或手指彈勻 靜置5min，于2mm電轉(zhuǎn)化杯中，電擊參數(shù)：1.5KV，25uF，200歐姆（不是400），一般放電時(shí)間在4.5-4.9ms之間，小于4說(shuō)明你的DNA鹽濃度太高 (9) 立即加入1ml Sorbitol，轉(zhuǎn)入10ml 離心管，30度靜置1小時(shí)，然后加入1ml YPD，30度，200rpm搖1小時(shí)，取50－200ul菌液涂100ul/ml YPDS板 (10) 一般轉(zhuǎn)化效率可以達(dá)到：200個(gè)以上轉(zhuǎn)化子每200ul菌液，足夠篩選表達(dá)菌株了。 方法六:酵母感受態(tài)細(xì)胞的制備 ⑴ 接種Pichia pastoris GS115于5 ml YPD液體培養(yǎng)基，30℃，250~300250 rpm ，過(guò)夜。 ⑵ 取200µl的培養(yǎng)物接種至含有500ml新鮮培養(yǎng)基的三角搖瓶中，28~30℃、250~300r/min培養(yǎng)過(guò)夜，一般12小時(shí)左右。 ⑶ 將細(xì)胞培養(yǎng)物于4℃，5000g離心5min，用500ml的冰預(yù)冷的無(wú)菌水將菌體沉淀重懸； ⑷ 按步驟3離心，用250ml的冰預(yù)冷的無(wú)菌水將菌體沉淀重懸； ⑸ 按步驟3離心，用20ml的冰預(yù)冷的1M的山梨醇溶液將菌體沉淀重懸； ⑹ 按步驟3離心，用1ml的冰預(yù)冷的1M的山梨醇溶液將菌體沉淀重懸，其終體積約為2ml； ⑺ NOTE：可將其分裝為200µl一份的包裝冷凍起來(lái)，但如果保存時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)影響其轉(zhuǎn)化效率。 |
2樓2009-10-20 14:50:24
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化學(xué)轉(zhuǎn)化 畢氏酵母氯化鋰轉(zhuǎn)化法 試劑 1. 1M LiCl：用去離子蒸餾水配制，濾膜過(guò)濾除菌；必要時(shí)用消毒去離子水稀釋 2. 50% PEG3350 ：Sigma P3640 用去離子蒸餾水配制，濾膜過(guò)濾除菌，用較緊的蓋子的瓶子分裝 3. 2mg/ml salmon sperm DNA / TE（10mM Tris-Cl, pH8.0, 1.0mM EDTA）-20℃保存 注：醋酸鋰對(duì)畢氏酵母無(wú)效，僅氯化鋰有效；PEG3350可屏蔽高濃度LiCl的毒害作用； 畢氏酵母的轉(zhuǎn)化 1. 煮沸1ml鮭魚(yú)精DNA 5min，迅速冰浴以制備單鏈擔(dān)體DNA； 2. 將感受態(tài)酵母菌離心，以Tips去除殘余的LiCl溶液； 3. 對(duì)于每一個(gè)轉(zhuǎn)化，按以下順序加入： 50% PEG3350 240ul 1M LiCl 36ul 2mg/ml 單鏈Salmon sperm DNA 25ul 5～10ug/50ul H2O 質(zhì)粒DNA 50ul 4. 劇烈旋渦混勻直至沉淀菌體完全分布均勻（約1min）； 5. 30℃水浴孵育30min； 6. 42℃水浴熱休克20～25min; 7. 6000～8000rpm離心收集酵母菌體； 8. 重懸酵母于1ml YPD培養(yǎng)基，30℃搖床孵育； 9. 1～4h后，取25～100ul菌液鋪選擇性培養(yǎng)基平板，于30℃培養(yǎng)2～3天鑒定（將表達(dá)菌株和對(duì)照菌株在固體培養(yǎng)基平板，30'c培養(yǎng)至轉(zhuǎn)化子出現(xiàn)） 畢氏酵母PEG1000轉(zhuǎn)化法 試劑 緩沖液A：1.0M Sorbitol，10mM Bicine，pH8.35（sigma）,3%（v/v）ethylene glycol 緩沖液B：40%（w/v）PEG1000（sigma），0.2M Bicine，pH8.35 緩沖液C：0.15M NaCl，10mM Bicine，pH8.35 未污染的新鮮、試劑級(jí)DMSO，-70℃保存 注：1. 緩沖液A、B、C均用濾膜過(guò)濾，-20℃保存; 2. 將DNA直接加在凍結(jié)的酵母細(xì)胞上是本實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵之處（即使在冰上解凍的待轉(zhuǎn)化細(xì)胞，其攝取外源DNA的能力也在解凍過(guò)程中迅速下降；如進(jìn)行多樣品的轉(zhuǎn)化，建議按6樣品/組進(jìn)行）; 待轉(zhuǎn)化畢氏酵母的制備 1. 接種環(huán)接種Pachia pastoris于YPD平板，30℃培養(yǎng)2d; 2. 挑取單克隆酵母菌株于10mlYPD培養(yǎng)基中，30℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜； 3. 取步驟2中小量菌液接種到100mlYPD培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，待其OD值從0.1升到0.5～0.8； 4. 室溫下3000g離心收集酵母菌體，50ml緩沖液A洗滌一次； 5. 重懸菌體于4ml緩沖液A中，按0.2ml/管分裝于1.5ml的離心管中，每管加入11ulDMSO，混合后迅速于液氮中冷凍， 6. -70℃保存 畢氏酵母的轉(zhuǎn)化 1. 將約50ug線性化質(zhì)粒DNA溶于20ul TE或水中，直接加于凍結(jié)的酵母細(xì)胞中；加入擔(dān)體DNA（40ug變性超聲線性化鮭魚(yú)精DNA）以獲得最大轉(zhuǎn)化率； 2. 37℃水浴孵育5min，中間混合樣品1～2次； 3. 取出離心管，加入1.5ml緩沖液B，徹底混勻； 4. 30℃水浴孵育1h； 5. 室溫下2000g離心10min，去除上清液，菌體沉淀重懸于1.5ml緩沖液C中； 6. 離心樣品，去除上清液，輕微操作將樣品重懸于0.2ml緩沖液C中； 7. 將所有轉(zhuǎn)化液鋪于選擇性平板，于30℃孵育3～4天后，鑒定； 畢赤酵母轉(zhuǎn)化方法有4 種 。最常用的是電轉(zhuǎn)化法和原生質(zhì)體法,其中電轉(zhuǎn)化法最為方便,轉(zhuǎn)化效率最高,最容易產(chǎn)生多拷貝整合。由于原生質(zhì)體法必須首先制備去除細(xì)胞壁的原生質(zhì)體細(xì)胞以利于DNA 進(jìn)入,然后細(xì)胞再生細(xì)胞壁,產(chǎn)生轉(zhuǎn)化體,而ZeocinR 抑制細(xì)胞壁的形成,導(dǎo)致不能產(chǎn)生轉(zhuǎn)化體。因此利用ZeocinR 作為選擇標(biāo)記的載體如p PICZ 系列,不能使用原生質(zhì)體法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。 資料來(lái)源：www.yiqi120.com |
3樓2009-10-20 14:51:29
paulajjh
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4樓2009-10-20 16:43:53
bioman9810
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5樓2009-10-22 09:46:10
rosalie161
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6樓2009-10-22 09:58:04
grape8260
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7樓2009-10-26 18:00:06
350784478
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shuangzi8761
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11樓2011-10-19 09:20:48
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ming051512樓
2012-07-20 18:27
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雪夜星辰1215樓
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