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shaojing690新蟲 (初入文壇)
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【分享】反向PCR的步驟 已有2人參與
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反向PCR （inverse-PCR）實驗步驟 inverse-PCR是克隆插入片段側(cè)翼序列非常有效的方法。通常采用的Tail-PCR假陽性太多，而Inverse-PCR一般只要有特異條帶，基本上就是目的片段。 基本步驟如下： 1、反向PCR（Inverse PCR）原理：反向PCR是克隆T-DNA插入位點側(cè)翼DNA序列非常有效的方法。 a. 選擇合適的限制性內(nèi)切酶位點。并在T-DNA的邊界（左邊界、右邊界均可）和酶切位點附近設(shè)計引物P1、P2； b. 回收DNA，T4連接酶連接，使酶切后的DNA片段環(huán)化； c. 回收連接后的DNA，用引物P1、P2做PCR，就可擴增到兩端為T-DNA插入序列，中間為側(cè)翼序列的片段。 2、限制性內(nèi)切酶消化：選擇合適的限制性內(nèi)切酶，基因組一定要切成彌散性的條帶。在酶切之前，應(yīng)對基因組DNA定量。 根據(jù)T-DNA的左邊界序列選擇合適的酶切位點EcoRI，BamHI和HindIII/PstI，并在酶切位點上游附近設(shè)計引物Z1，Z2，Z3和Z4，然后用這些內(nèi)切酶分別消化基因組DNA，酶切體系如下： Buffer for EcoR I 2μl Genomic DNA 3μl EcoR I 0.5μl （10u/μl） ddH2O 14.5 μl 20μl 37度 過夜，電泳檢測酶切效果。 3、回收DNA ① 將酶切產(chǎn)物轉(zhuǎn)到1.5ml離心管中，用ddH2O洗滌干凈，并稀釋到250μl； ② 加入等體積的酚和氯仿（V：V=1：1），渦旋混勻，室溫靜置1min； ③ 最大速度（13, 000 rpm）離心1min； ④ 將上清移到另一管中，加入等體積的氯仿，渦旋混勻，室溫靜置1min； ⑤ 最大速度（13, 000 rpm）離心2min； ⑥ 將上清移到另一管中，加入2.5倍體積的-20℃預(yù)冷的無水乙醇，0.1倍體積的3M 乙酸鈉（pH=5.2），輕輕振蕩混勻，室溫靜置5min； ⑦ 4℃最大速度（13, 000 rpm）離心10~15min； ⑧ 棄上清，盡量除去管壁上的液體； ⑨ 加入1ml -20℃預(yù)冷的70%乙醇，輕輕顛倒幾次。最大速度（13, 000 rpm）離心5min； ⑩ 除去乙醇，在超凈臺上平放，將管壁上的乙醇揮發(fā)掉，20~40μl ddH2O溶解。-20℃保存。 4、連接。體系如下： DNA 2μl 10×buffer 10μl T4 ligase 1μl ddH2O 87μl 100μl 12-14℃ overnight 連接體系比較大，而DNA含量比較低，不需加入PEG4000，這樣可以促進分子內(nèi)的連接，減少分子間的連接。試驗中我們采取蹇文嬰等（2002）的方法（12-14℃連接48h）。連接完成后，65℃ 水浴10min滅活。按上述3.抽提回收，溶解于40μl ddH2O中。 然后就可以用回收的鏈接片段做PCR了。 |
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2樓2010-06-02 17:09:00
范兒
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3樓2012-11-14 21:18:21
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