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【資源】HPLC：色譜柱的使用與維護(hù) 已有11人參與
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分析高效液相色譜(HPLC)是20世紀(jì)60年代后期發(fā)展起來(lái)的分離分析技術(shù)，是現(xiàn)代分離測(cè)定的重要手段。問(wèn)世以來(lái)，因其具有分離效能高、分析速度快、檢測(cè)靈敏度好、能分析高沸點(diǎn)但不能氣化的熱不穩(wěn)定生理活性物質(zhì)的特點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于生物化學(xué)、藥物及臨床分析。高效液相色譜是用高壓輸液泵將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑，緩沖液等流動(dòng)相泵入裝有固定相的色譜柱，經(jīng)進(jìn)樣閥注入待測(cè)樣品，儀器分析 由流動(dòng)相帶入柱內(nèi)，在柱內(nèi)各成分被分離后依次進(jìn)入檢測(cè)器，色譜信號(hào)由記錄儀、積分儀或色譜工作站記錄。 色譜柱是高效液相色譜的心臟，在高效液相色譜儀的使用中，保持色譜柱的柱效、容量和滲透粉性，延長(zhǎng)柱子的使用壽命非常重要。因此對(duì)高效液相色譜柱的維護(hù)是關(guān)鍵。 1 色譜柱的構(gòu)造 色譜柱由柱管、壓帽、卡套(密封環(huán))、篩板(濾片)、接頭、螺絲等組成。柱管多用不銹鋼制成，壓力不高于70㎏/㎝2 時(shí)，也可采用厚壁玻璃或石英管，管內(nèi)壁要求有很高的光潔度。為提高柱效，減小管壁效應(yīng)，不銹鋼柱內(nèi)壁多經(jīng)過(guò)拋光。還有使用熔融硅或玻璃襯里的，用于細(xì)管柱。色譜柱兩端的柱接頭內(nèi)裝有篩板，是燒結(jié)不銹鋼或欽合金，孔徑0.2-20 μm(5-10μm)，取決于填料粒度，目的是防止填料漏出。 色譜柱按用途可分為分析型和制備型兩類，尺寸規(guī)格也不同: (I)常規(guī)分析柱(常量柱)，內(nèi)徑2-5mm(常用4.6mm，國(guó)內(nèi)有4mm和5mm )，柱長(zhǎng)10-30cm ; (2)窄徑柱，又稱細(xì)管徑柱、半微柱，內(nèi)徑1 -2mm ,柱長(zhǎng)10-20cm; (3)毛細(xì)管柱(又稱微柱)，內(nèi)徑0.2-0.5mm; (4)半制備柱，內(nèi)徑>5mm; (5)實(shí)驗(yàn)室制備柱，內(nèi)徑20-40rnm，柱長(zhǎng)10-30cm; (6)生產(chǎn)制備柱內(nèi)徑可達(dá)幾十厘米。柱內(nèi)徑一般是根據(jù)柱長(zhǎng)、填料粒徑和折合流速來(lái)確定，分析目的是為了避免管壁效應(yīng)。 2色譜柱的使用和維護(hù) 儀器分析 在日常分離分析工作中，色譜柱的正確使用和維護(hù)十分重要，色譜柱使用是否得當(dāng)，直接影響色譜柱的壽命，稍有不慎就會(huì)降低柱效、縮短使用壽命甚至損壞。在色譜操作過(guò)程中，需要注意下列問(wèn)題，以維護(hù)色譜柱。 (1)柱子在裝卸、更換時(shí)，動(dòng)作要輕，接頭擰緊要適度。必須防止較強(qiáng)的機(jī)械振動(dòng)，以免柱床產(chǎn)生空隙。 (2)如果儀器用來(lái)做常規(guī)分析，樣品種類有限，但分析次數(shù)多，則不妨為每一類常規(guī)分析配置一根專用柱，這樣有助于延長(zhǎng)柱子的壽命。 (3)避免壓力和溫度的急劇變化及任何機(jī)械震動(dòng)。溫度的突然變化或者使色譜柱從高處掉下都會(huì)影響柱內(nèi)的填充狀況;柱壓的突然升高或降低也會(huì)沖動(dòng)柱內(nèi)填料，因此在調(diào)節(jié)流速時(shí)應(yīng)該緩慢進(jìn)行，在閥進(jìn)樣時(shí)閥的轉(zhuǎn)動(dòng)不能過(guò)緩。 (4)應(yīng)逐漸改變?nèi)軇┑慕M成，特別是反相色譜中，不應(yīng)直接從有機(jī)溶劑改變?yōu)槿渴撬�，反之亦然�?br /> (5)如使用柱溫控制裝置時(shí)，應(yīng)注意在通人流動(dòng)相后才能升溫。 (6)一般說(shuō)來(lái)色譜柱不能反沖，只有生產(chǎn)者指明該柱可以反沖時(shí)，才可以反沖除去留在柱頭的雜質(zhì)。否則反沖會(huì)迅速降低柱效。 (7)儀器分析 選擇使用適宜的流動(dòng)相，以避免固定相被破壞。有時(shí)可以在進(jìn)樣器前面連接一個(gè)預(yù)柱，分析柱是鍵合硅膠時(shí)，預(yù)柱為硅膠，可使流動(dòng)相在進(jìn)入分析柱之前預(yù)先被硅膠“飽和”，避免分析柱中的硅膠基質(zhì)被溶解。 (8)避免將基質(zhì)復(fù)雜的樣品尤其是生物樣品直接注人柱內(nèi)，需要對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理或者在進(jìn)樣器和色譜柱之間連接一個(gè)保護(hù)柱。保護(hù)柱一般是填有相似固定相的短柱。保護(hù)柱可以而且應(yīng)該經(jīng)常更換。 (9)經(jīng)常用強(qiáng)溶劑沖洗色譜柱，清除保留在柱內(nèi)的雜質(zhì)。在進(jìn)行清洗時(shí)，對(duì)流路系統(tǒng)中流動(dòng)相的置換應(yīng)以相混溶的溶劑逐漸過(guò)渡，每種流動(dòng)相的體積應(yīng)是柱體積的20倍左右，即常規(guī)分析需要50-75mL。 (10)保存色譜柱時(shí)應(yīng)將柱內(nèi)充滿乙腈或甲醇，柱接頭要擰緊，防止溶劑揮發(fā)干燥。絕對(duì)禁止將緩沖溶液留在柱內(nèi)靜置過(guò)夜或更長(zhǎng)時(shí)間。 (11)色譜柱使用過(guò)程中，如果壓力升高，一種可能是燒結(jié)濾片被堵塞，這時(shí)應(yīng)更換濾片或?qū)⑵淙〕鲞M(jìn)行清洗;另一種可能是大分子進(jìn)人柱內(nèi)，使柱頭被污染;如果柱效降低或色譜峰變形，則可能柱頭出現(xiàn)塌陷，死體積增大。 (12)在完成分離分析工作之后，不應(yīng)立即停機(jī)，需及時(shí)對(duì)色譜分析系統(tǒng)進(jìn)行沖洗，一般0.5h以上，以除去色譜柱內(nèi)的雜質(zhì)。 兩篇感覺不錯(cuò)的文章，值得看看：《液相紫外檢測(cè)器內(nèi)部結(jié)構(gòu)及工作原理》 《分享：紅外光譜樣品制備，相關(guān)經(jīng)驗(yàn)！》 3色譜柱的再生 因?yàn)楦咝б合嗌V柱是消耗品，隨著使用時(shí)間或進(jìn)樣次數(shù)的增加，當(dāng)出現(xiàn)色譜峰高陣低，峰寬加大或出現(xiàn)肩峰時(shí)，一般來(lái)說(shuō)可能是柱效下降。 (1 )反相柱的再，采用以甲醇:水=95: 5(V/V),純甲醇，二氯甲烷等溶劑作流動(dòng)相，順次沖洗，每種流動(dòng)相流經(jīng)色譜柱的量為2030倍色譜柱體積然后再以相反順序沖洗色譜柱。 (2)正相柱再生。順次以正己烷、異丙醇、二氯甲烷、甲醇作流動(dòng)相沖洗色譜柱每步注意平衡溶劑的順序，不要顛倒每種流動(dòng)相流經(jīng)色譜柱的量為20-30倍柱體積(因異丙醇的粘度較大，沖洗過(guò)程中請(qǐng)隨時(shí)注意調(diào)整沖洗的流速)，用甲醇沖洗完后，再以相反的順序沖洗色譜柱。要注意上述溶劑必需嚴(yán)格脫水。 (3)離子交換柱的再生。長(zhǎng)時(shí)間在高pH值和高離子強(qiáng)度緩沖溶液中使用，將導(dǎo)致色譜柱離子交換能力降低。用稀酸緩沖溶液沖洗，可使陽(yáng)離子柱再生;反之，用稀堿緩沖溶液沖洗，可使陰離子柱再生。以上色譜柱的再生方法并不是絕對(duì)的標(biāo)準(zhǔn)方法，使用者可根據(jù)自己的實(shí)際經(jīng)驗(yàn)和目的，選擇合適的并能溶解柱內(nèi)污染物的溶劑作流動(dòng)相，按正方向或反方向的沖洗。 但是需要指出是，儀器分析 無(wú)論采用什么方法再生色譜柱，均不可能完全隊(duì)復(fù)柱效或其他參數(shù)至新柱水平。 4色譜柱的發(fā)展方向 因強(qiáng)調(diào)分析速度而發(fā)展出短柱，柱長(zhǎng)3-10cm，填料粒徑2-3 μm。為提高分析靈敏度，與質(zhì)譜(MS)聯(lián)接，而發(fā)展出窄徑柱、毛細(xì)管柱和內(nèi)徑小于0.2mm的微徑柱。細(xì)管徑柱的優(yōu)點(diǎn)是:節(jié)省流動(dòng)相、靈敏度增加、樣品量少、能使用長(zhǎng)柱達(dá)到高分離度、容易控制柱溫、易 于實(shí)現(xiàn)LC-MS聯(lián)用。 但由于柱體積越來(lái)越小，柱外效應(yīng)的影響就更加顯著，需要更小池體積的檢測(cè)器(甚至采用柱上檢測(cè))，更小死體積的柱接頭和連接部件。配套使用的設(shè)備應(yīng)具備如下性能:輸液泵能情密輸出1-100μL/min的低流量，進(jìn)樣閥能準(zhǔn)確、重復(fù)地進(jìn)樣微小體積的樣品。且因上樣量小，要求高靈敏度的檢測(cè)器，電化學(xué)檢測(cè)器和質(zhì)譜儀在這方面具有突出優(yōu)點(diǎn)。 [ Last edited by skymahaol on 2010-6-28 at 10:23 ] |
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 藥物分析 | x55-01 | 《分析版》資源整理 |
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