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beisimai895木蟲 (小有名氣)
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[交流]
【求助/交流】TA克隆為什么會長出藍斑 已有4人參與
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| 請教一個問題，TA克隆完藍白篩，會長出藍斑嗎？T載體不是倆頭都是A尾嗎？應該不會自連吧，還有，T載體可做去磷酸化嗎？ |
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2樓2010-07-15 10:48:34
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3樓2010-07-15 11:41:51
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4樓2010-07-15 11:44:01
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1949stone(金幣+2):謝謝交流 2010-07-15 12:55:43
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一種情況是單鏈突出的T容易降解，尤其T載體上是3'的突出末端，在沒有分裝，反復凍融的情況下容易發(fā)生。大家平時都認為出現(xiàn)藍斑是因為這種載體自連，但是這種情況的發(fā)生要求兩端T都降解才行，實際情況中只占很少一部分。 比較多的情況是買來的載體里面本身就有環(huán)狀質(zhì)粒，或者線狀質(zhì)粒末端本身就沒有T而發(fā)生的自連，這兩種都是T載體質(zhì)量的問題 如果你看過T載體制備的過程的話，應該能理解這兩種情況的出現(xiàn)。 T載體也是用一般的克隆載體制備的，先用平末端的酶切（常見的有Sma I或者Eco RV），然后再利用Taq的特性給兩條鏈平末端的3'端加上T。大家都知道Taq酶在dNTP存在的情況下會給3'端加A，這個反應不需要模板。實際上Taq酶并不是只能加A，而是在四種核苷酸都存在的情況下傾向于加A。事實上如果體系里面只有dTTP的話，Taq酶也能加T。 因此T載體制備主要就是兩個步驟，酶切和加T。 如果酶切不完全，體系里殘留有沒切開的超螺旋質(zhì)粒，產(chǎn)物又沒有切膠純化的話，殘留的野生質(zhì)粒就會留在最終的產(chǎn)品里，轉(zhuǎn)化到感受態(tài)里，形成藍斑 如果加T不完全，就會有線性平末端、沒有T的質(zhì)粒殘留，就會在連接體系中發(fā)生自連而產(chǎn)生藍斑 如果用的是promega、takara之類大公司的T載體，這種情況還少一點。如果是國內(nèi)公司的產(chǎn)品，質(zhì)量真的不敢保證。 當然T載體的制備也有另一種方法（連接接頭，Xcm I酶切）。但是根據(jù)現(xiàn)在的T載體T兩端緊接的就是MCS來看，應該還是上面說的這種方法。 其實知道了方法，自己就可以做T載體，用不同的克隆載體做，pUC系列，pBluescript系列等等，甚至可以把表達載體做成T載體。我們實驗室就是用的自己做的T載體，可以根據(jù)目的片段內(nèi)部的酶切位點是否合適來選擇不同的載體，比只有買來的一種載體方便多了。 |
5樓2010-07-15 12:14:06
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