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sdluqun鐵桿木蟲 (著名寫手)
板磚隊長
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[交流]
【求助/交流】求助TA克隆問題 已有9人參與
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前天做的目的片段PCR并且膠回收，經(jīng)瓊脂糖檢測，4微升上樣量，條帶亮度大約D2000 Marker 中的750條帶的兩倍，即含量約為300ng/ul。當(dāng)天晚上做上連接，用的是promega的T載體：5ul 2*buffer; 1ul T4連接酶; 1ul（50ng/ul） pGEM-T easy 載體; 3/2/1ul 回收的目的片段; ddH2O補(bǔ)齊至10ul體系。 前天晚上接菌DH5α，昨天早上轉(zhuǎn)接，之后氯化鈣法制備了感受態(tài)，放置4小時，轉(zhuǎn)化，搖菌，涂板。平板翻過來的時間為20：30，今天早上來實(shí)驗室看看，陽性對照和樣品都是一片空白，郁悶， 懇求高手指點(diǎn)�。�！ PS：我的目的基因在1400bp左右，是不是片段偏大不好連呢？ [ Last edited by sdluqun on 2010-6-10 at 19:44 ] |
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silicare
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2樓2010-06-09 11:19:46
liyong1981 
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3樓2010-06-09 11:42:12
ben1147
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★ ★ ★
amisking(金幣+3):好建議！ 2010-06-09 12:30:31
amisking(金幣+3):好建議！ 2010-06-09 12:30:31
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新制備的感受態(tài)用之前一定要檢驗 一是不轉(zhuǎn)東西直接涂抗性板，看看有沒有污染 二是轉(zhuǎn)定量的超螺旋質(zhì)粒，計算轉(zhuǎn)化效率。一般氯化鈣做的感受態(tài)在(10^6~10^7 )cfu/ug DNA 比較正常，太低的話轉(zhuǎn)連接產(chǎn)物很容易得不到陽性克隆 要求高的話可以用一些改進(jìn)的制備液（MnCl2，KCl，CaCl2等鹽組成），做得好的話能到10^8 [ Last edited by ben1147 on 2010-6-9 at 13:13 ] |
4樓2010-06-09 11:50:27
fywjp
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ben1147
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