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[交流]
【求助/交流】急！克隆快做了一個月了，就是做不出來 已有20人參與
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TA 克隆 載體：pMD 18-T(Takara) 感受態(tài)：DH5a (天根) 實(shí)驗(yàn)流程是基本按照分子克隆上說的 PCR產(chǎn)物做了純化，由于濃度比較低，所以 載體：0.5ul PCR產(chǎn)物：4.5ul Solution I: 5ul 14-16°連接過夜 轉(zhuǎn)化用100ul的感受態(tài)細(xì)胞 熱激什么的都沒有問題，復(fù)蘇后濃縮成100ul全部涂板，但是就是不長東西。做了陽性對照，也沒長。好奇怪啊，不知道是哪里出了問題。 |
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susizheng
木蟲 (著名寫手)
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2樓2010-12-28 14:08:49
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lhwei1987
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4樓2010-12-28 15:26:09
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小木蟲(金幣+0.5):給個紅包，謝謝回帖交流
dhd997(金幣+3):good 2010-12-29 17:06:49
小木蟲(金幣+0.5):給個紅包，謝謝回帖交流
dhd997(金幣+3):good 2010-12-29 17:06:49
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建議： 1:重新做感受態(tài)細(xì)胞，細(xì)胞并不是濃度越大越好，我們一般是50-60ul，再轉(zhuǎn)化； 2：重新連接，把連接體系可以稍微變一下，DNA量可以稍微加大一些，一般如果沒有連上的話，細(xì)胞再好，也不會長的，不知道你的質(zhì)粒是什么抗性，當(dāng)然了也可以把抗生素濃度降低一些！ 3：連接時間可以長一些，一般都是過夜連接，記得我上次連接幾個基因，連了7，8個小時吧，轉(zhuǎn)化之后涂布就長了幾個，可是驗(yàn)證是正確的，后來連接一個基因，連接了15個小時吧，然后涂布，長的很多，挑了幾個驗(yàn)證，都是正確的！ |
5樓2010-12-28 15:30:25
知秋
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9樓2010-12-29 16:47:25
10樓2010-12-29 17:01:47
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