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[交流]
做一個克隆所需的最短時間？比比誰更高效快速！
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克隆一個基因： 第一天：小體系PCR（上午）-大體系回收（下午）-小樣酶切-大體系酶切回收（包括載體）（晚上）-連接 第二天：早晨轉(zhuǎn)化-晚上搖菌 第三天：PCR鑒定和提質(zhì)粒酶切鑒定（上午提，下午鑒定） 一切順利的情況下，緊忙乎，有沒有更快更更高效的體系啊？ 求交流！ |
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2樓2011-08-09 22:49:02
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小木蟲(金幣+0.5):給個紅包，謝謝回帖
西瓜(金幣+3): 鼓勵分享經(jīng)驗 2011-08-11 12:04:05
shuihaizi(金幣+3): 2011-08-11 13:18:23
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西瓜(金幣+3): 鼓勵分享經(jīng)驗 2011-08-11 12:04:05
shuihaizi(金幣+3): 2011-08-11 13:18:23
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PCR 用pfu 或者PBO；連接酶用fermentas的T4連接酶，不過buffer我們公司自己配的，后來我試了一下他們公司帶的buffer，也挺好用的； 菌落PCR就是先挑單菌落在200ml的培養(yǎng)基中搖菌1h，然后取2.5ul做PCR（30ul反應(yīng)體系） 反應(yīng)體系 體積 H2O 23 μl 10 ×PCR緩沖液 3 μl 正向引物 (50pmol/μl) 0.5 μl 反向引物 (50pmol/μl) 0.5μl DNTP (10mmol/L each) 0.3 μl 菌液 2.5 μl Taq DNA聚合酶 (5U/μl) 0.2 μl 總體系 30 μl |
14樓2011-08-10 19:34:51
15樓2011-08-11 08:36:24
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西瓜(金幣+4): good 2011-08-16 11:52:27
shuihaizi(金幣+2): 2011-08-23 16:18:42
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西瓜(金幣+4): good 2011-08-16 11:52:27
shuihaizi(金幣+2): 2011-08-23 16:18:42
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另外IN FUSION，LIC等方法。連酶切連接一步都基本省掉了。更能節(jié)省時間。 看文獻大規(guī)模高通量做構(gòu)建的時候，均采用上述構(gòu)建方法。 如果對PCR很有信心，是不是連切膠都可以省掉，直接過一遍PCR純化柱。 另外現(xiàn)在的快速連接，5-10min搞定。、 最后質(zhì)粒也不需要那么復雜，菌落PCR鑒定，甚至快檢跑個電泳證明有插入基因�；蛘哌B鑒定都不鑒定（前提載體做得好）直接送測序，反正現(xiàn)在測序也便宜的很。 不過在學校的話，真是沒有必要這么趕，認認真真老老實實，一步一步進行，做好對照，一次成功才是王道 |
23樓2011-08-15 17:08:18
24樓2011-08-15 17:15:31
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shuihaizi(金幣+3): 2011-08-16 11:14:19
西瓜(金幣+4): 這都是經(jīng)驗啊 2011-08-16 11:52:12
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shuihaizi(金幣+3): 2011-08-16 11:14:19
西瓜(金幣+4): 這都是經(jīng)驗啊 2011-08-16 11:52:12
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PCR不一定要摸條件，其實連接至需要很少量的DNA分子就夠了，在你跑膠的時候只需要有隱約的條帶就夠了，甚至更少的兩都行。 轉(zhuǎn)化只需要冰浴15分鐘足夠了，過后的搖菌只是讓感受態(tài)菌恢復。時間長短沒事。柱子直接用DNA膠回收柱就可以了。 從你說的條件也是T載體的要求啊。 如果是亞克隆，可以把回收后的PCR產(chǎn)物直接進行酶切處理，然后再過柱回收。載體片段也可以同樣的方法。因為像幾十bp的小片段，回收柱回收不回來。所以都可以直接用DNA回收柱直接回收。 |
25樓2011-08-16 09:00:22
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