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nutplay新蟲(chóng) (初入文壇)
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[交流]
【求助/交流】急！克隆快做了一個(gè)月了，就是做不出來(lái) 已有20人參與
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TA 克隆 載體：pMD 18-T(Takara) 感受態(tài)：DH5a (天根) 實(shí)驗(yàn)流程是基本按照分子克隆上說(shuō)的 PCR產(chǎn)物做了純化，由于濃度比較低，所以 載體：0.5ul PCR產(chǎn)物：4.5ul Solution I: 5ul 14-16°連接過(guò)夜 轉(zhuǎn)化用100ul的感受態(tài)細(xì)胞 熱激什么的都沒(méi)有問(wèn)題，復(fù)蘇后濃縮成100ul全部涂板，但是就是不長(zhǎng)東西。做了陽(yáng)性對(duì)照，也沒(méi)長(zhǎng)。好奇怪啊，不知道是哪里出了問(wèn)題。 |
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susizheng
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先轉(zhuǎn)個(gè)空質(zhì)�？纯锤惺軕B(tài)是否有問(wèn)題先。 如果感受態(tài)沒(méi)問(wèn)題，陽(yáng)性對(duì)照都不長(zhǎng)，應(yīng)該要考慮盒子的問(wèn)題了。 再就是你的片段多大？超過(guò)3K，pMD18-T連起來(lái)就有點(diǎn)難度了。 [ Last edited by susizheng on 2010-12-28 at 14:09 ] |
2樓2010-12-28 14:08:49
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4樓2010-12-28 15:26:09
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dhd997(金幣+3):good 2010-12-29 17:06:49
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dhd997(金幣+3):good 2010-12-29 17:06:49
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建議： 1:重新做感受態(tài)細(xì)胞，細(xì)胞并不是濃度越大越好，我們一般是50-60ul，再轉(zhuǎn)化； 2：重新連接，把連接體系可以稍微變一下，DNA量可以稍微加大一些，一般如果沒(méi)有連上的話，細(xì)胞再好，也不會(huì)長(zhǎng)的，不知道你的質(zhì)粒是什么抗性，當(dāng)然了也可以把抗生素濃度降低一些！ 3：連接時(shí)間可以長(zhǎng)一些，一般都是過(guò)夜連接，記得我上次連接幾個(gè)基因，連了7，8個(gè)小時(shí)吧，轉(zhuǎn)化之后涂布就長(zhǎng)了幾個(gè)，可是驗(yàn)證是正確的，后來(lái)連接一個(gè)基因，連接了15個(gè)小時(shí)吧，然后涂布，長(zhǎng)的很多，挑了幾個(gè)驗(yàn)證，都是正確的！ |
5樓2010-12-28 15:30:25
知秋
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6樓2010-12-28 15:48:16
poog502
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rainwander(金幣+1):鼓勵(lì)積極參與~~~ 2010-12-29 17:11:57
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rainwander(金幣+1):鼓勵(lì)積極參與~~~ 2010-12-29 17:11:57
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實(shí)話說(shuō)pMD 18-T的載體空質(zhì)�；蛘哌B接其他片段、小片段的幾率很高，我的效率是100個(gè)克隆中有3-5個(gè)陽(yáng)性克隆。你這么著急的話換成promega的pGEM-T easy vector這個(gè)效率才是號(hào)稱的98%以上，這么說(shuō)我就從沒(méi)挑到過(guò)假陽(yáng)性的，⊙﹏⊙b汗，說(shuō)真的，缺點(diǎn)就是貴、合適的酶切位點(diǎn)少 |
7樓2010-12-28 15:53:00
poog502
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8樓2010-12-28 15:53:44
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9樓2010-12-29 16:47:25
10樓2010-12-29 17:01:47
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