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xinyaolu木蟲 (小有名氣)
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[交流]
【求助/交流】大腸桿菌表達(dá)，有蛋白無酶活，如何解決 已有5人參與
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| 各位大俠，最近在表達(dá)一個100KD左右的蛋白，含有兩個二硫鍵，基因中有稀有密碼子，使用了pET32a作為載體，同時用Rosetta-gami作為宿主。25℃誘導(dǎo)，IPTG0.8mM.蛋白電泳有非常明顯的條帶，但是胞內(nèi)可溶部分未能測到酶活，同時電泳現(xiàn)實胞內(nèi)可溶部分也有蛋白條帶。請問各位高手，如何優(yōu)化才能實現(xiàn)蛋白的正確折疊，測到酶活，非常感謝 |
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木蟲 (正式寫手)
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2樓2010-07-15 20:09:47
lwiaanngg
鐵桿木蟲 (著名寫手)
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小木蟲(金幣+0.5):給個紅包，謝謝回帖交流
看天(金幣+5):謝謝分享 2010-07-16 11:01:00
小木蟲(金幣+0.5):給個紅包，謝謝回帖交流
看天(金幣+5):謝謝分享 2010-07-16 11:01:00
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第一，分析一下你表達(dá)蛋白的來源，原核還是真核。 第二，IPTG濃度有點高，適當(dāng)降低點。降溫就不必了，25度不算高了，如果你想試，16，或20度看看了。但有一種情況，有的酶在降溫后表達(dá)量上去了，但酶活降低；但在37C可溶表達(dá)很少。最終條件你要試一試了。 第三，盡量不要嘗試復(fù)性，有二硫鍵的話不容易做。你可以去看看Rosetta-gami中chaperone有哪些，是否有能折疊你目標(biāo)蛋白的。如果沒有，你可以采用的方法：1) 添加指定的chaperone，2）使用通用的chaperone，3）密碼子優(yōu)化一下（這個方法我只是聽說過有可能） |
3樓2010-07-16 09:36:31
4樓2010-07-16 10:01:44
5樓2016-03-12 18:58:05
6樓2018-11-26 15:00:59
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