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shaojing690版主
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【分享】SDS-PAGE電泳原理及蛋白質(zhì)定量測定 已有5人參與
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SDS-PAGE電泳原理及蛋白質(zhì)定量測定(2008-10-23 16:04:31) 一、原理： 聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺 (簡稱Acr) 和交聯(lián)劑N，N’—亞甲基雙丙烯酰胺（簡稱Bis）在催化劑作用下，聚合交聯(lián)而成的具有網(wǎng)狀立體結(jié)構(gòu)的凝膠，并以此為支持物進(jìn)行電泳。聚丙烯酰胺凝膠電泳可根據(jù)不同蛋白質(zhì)分子所帶電荷的差異及分子大小的不同所產(chǎn)生的不同遷移率將蛋白質(zhì)分離成若干條區(qū)帶，如果分離純化的樣品中只含有同一種蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)樣品電泳后，就應(yīng)只分離出一條區(qū)帶。 SDS是一種陰離子表面活性劑能打斷蛋白質(zhì)的氫鍵和疏水鍵，并按一定的比例和蛋白質(zhì)分子結(jié)合成復(fù)合物，使蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷的量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過其本身原有的電荷，掩蓋了各種蛋白分子間天然的電荷差異。因此，各種蛋白質(zhì)-SDS 復(fù)合物在電泳時(shí)的遷移率，不再受原有電荷和分子形狀的影響，而只是棒長的函數(shù)。這種電泳方法稱為SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（簡稱SDS—PAGE）。由于SDS-PAGE 可設(shè)法將電泳時(shí)蛋白質(zhì)電荷差異這一因素除去或減小到可以略而不計(jì)的程度，因此常用來鑒定蛋白質(zhì)分離樣品的純化程度，如果被鑒定的蛋白質(zhì)樣品很純，只含有一種具三級(jí)結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)或含有相同分子量亞基的具四級(jí)結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，那么SDS—PAGE 后，就只出現(xiàn)一條蛋白質(zhì)區(qū)帶。 SDS—PAGE 可分為圓盤狀和垂直板狀、連續(xù)系統(tǒng)和不連續(xù)系統(tǒng)。本實(shí)驗(yàn)采用垂直板狀不連續(xù)系統(tǒng)。所謂“不連續(xù)”是指電泳體系由兩種或兩種以上的緩沖液、pH 和凝膠孔徑等所組成。 1.蛋白樣品濃縮效應(yīng) 在不連續(xù)電泳系統(tǒng)中，含有上、下槽緩沖液(Tris—Gly，pH8.3)、濃縮膠緩沖液(Tris—HCl，pH6.8)、分離膠緩沖液(Tris—HCl，pH8.8)，兩種凝膠的濃度(即孔徑)也不相同。在這種條件下，緩沖系統(tǒng)中的HCl 幾乎全部解離成Cl－，兩槽中的Gly (pI＝6.0，pK a=9.7)只有很少部分解離成Gly 的負(fù)離子，而酸性蛋白質(zhì)也可解離出負(fù)離子。這些離子在電泳時(shí)都向正極移動(dòng)。C1—速度最快(先導(dǎo)離子)，其次為蛋白質(zhì)，Gly 負(fù)離子最慢(尾隨離子)。由于C1—很快超過蛋白離子，因此在其后面形成一個(gè)電導(dǎo)較低、電位梯度較陡的區(qū)域，該區(qū)電位梯度最高，這是在電泳過程中形成的電位梯度的不連續(xù)性，導(dǎo)致蛋白質(zhì)和Gly 離子加快移動(dòng)，結(jié)果使蛋白質(zhì)在進(jìn)入分離膠之前，快、慢離子之間濃縮成一薄層，有利于提高電泳的分辨率。 2.分子篩效應(yīng) 蛋白質(zhì)離子進(jìn)入分離膠后，條件有很大變化。由于其pH 升高(電泳進(jìn)行時(shí)常超過9.0)，使Gly 解 離成負(fù)離子的效應(yīng)增加；同時(shí)因凝膠的濃度升高，蛋白質(zhì)的泳動(dòng)受到影響，遷移率急劇下降。此兩項(xiàng)變化，使Gly 的移動(dòng)超過蛋白質(zhì)，上述的高電壓梯度不復(fù)存在，蛋白質(zhì)便在一個(gè)較均一的pH 和電壓梯度環(huán)境中，按其分子的大小移動(dòng)。分離膠的孔徑有一定的大小，對(duì)不同相對(duì)分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)來說，通過時(shí)受到的阻滯程度不同，即使凈電荷相等的顆粒，也會(huì)由于這種分子篩的效應(yīng)，把不同大小的蛋白質(zhì)相互分開。 二，定量注意事項(xiàng) 1. 用SDS-PAGE測定蛋白質(zhì)相對(duì)分子量時(shí)，必須同時(shí)作標(biāo)準(zhǔn)曲線。而且每次都要同時(shí)用作標(biāo)準(zhǔn)曲線，現(xiàn)做現(xiàn)用，不可相互挪用。SDS-PAGE測定分子量有10％誤差，不可完全信任。 2. SDS與蛋白質(zhì)的結(jié)合成比例（即：1.4gSDS /g蛋白質(zhì)），蛋白質(zhì)含量不可過量，否則SDS結(jié)合量不足，會(huì)使測量結(jié)果出現(xiàn)偏差。 4. 有的蛋白質(zhì)（如：電荷異�；蚪Y(jié)構(gòu)異常的蛋白質(zhì)；帶有較大輔基的蛋白質(zhì)）不能采用該法測相對(duì)分子量。 5. 如果該電泳中出現(xiàn)拖尾、染色帶的背景不清晰等現(xiàn)象，可能是SDS不純引起 |
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