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sqhnsd金蟲 (正式寫手)
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[交流]
【求助】RP-HPLC分離蛋白質(zhì)樣品遇到的奇怪現(xiàn)象 已有5人參與
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本人最近在做RP-HPLC分離蛋白質(zhì) 柱子：C8 孔徑 300 A A液： 98% 水 2% 乙腈 0.1% TFA B液： 90% 乙腈 10%水 0.1% TFA 樣本均為蛋白質(zhì)復(fù)雜樣本，每個組分大概包括50-100個左右的蛋白，只是分力量不同（樓下有圖） A-B: <20KD C-H: 20-150 KD （c-h 分子量逐漸增大） A-B圖分離效果還可以接受，但是C-H分離效果很差，不知道原因，請高手指點。 另外，我考慮可能是蛋白質(zhì)分離比較大 300 A的孔徑可能不合適，但是我改用1000A的柱子效果也差不多是這樣。請有相關(guān)方面經(jīng)驗的高手指教。 |
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電洗脫的時候，里面有200mM的glycine，在丙酮沉淀之前我還對樣品進行凍干以提高蛋白濃度，增加 actone precipitation回收率。但是，當(dāng)弄干之后，鹽分鹽濃度就很高了（200mM其實已經(jīng)比較高了），高鹽情況下去除SDS效果不好（文章推薦除鹽）。還有，大部分蛋白在0-60%乙腈的條件下都會洗掉，90%跟100%差別不大。另外，actone precipitation可以去除大部分SDS，因此必須放到RP-HPLC之前。你說的很對，我也覺得丙酮沉淀之后的蛋白，怪怪的 [ Last edited by sqhnsd on 2010-8-13 at 15:14 ] |
11樓2010-08-13 15:11:38
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zxz.1982(金幣+1):感謝交流 2010-08-13 15:04:29
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看著圖確實很怪異， 怎么都不到基線呢？ 你為啥不用 A液： 100%水 0.1% TFA B液： 100% 乙腈 0.1% TFA 這樣的話，在乙腈達(dá)到100%的時候，一切疏水的凍洗都應(yīng)該下來，如果還不回到基線，那就說明你的樣品有問題， 沒有那個分子的有那么強的疏水性質(zhì)。 看你的這個圖，感覺分辨率很低。 另外你為啥要在丙酮沉淀去除鹽和SDS后上HPLC，丙酮除掉鹽的時候難道鹽不會也析出來？ 按照經(jīng)驗，當(dāng)樣品中鹽離子很高的時候，在用有機溶劑沉淀蛋白的時候，鹽離子也是可以被沉淀下來的。反相柱子可以脫鹽，但是多了對機器不好。 另外丙酮沉淀后，很多蛋白性質(zhì)會很怪的，我想一般這一步不應(yīng)該放在這么靠后。 電洗脫這個步驟也太靠前了，感覺， 感覺應(yīng)該是你的樣品含有某種東西，但是說不好是什么？ |
7樓2010-08-13 14:14:57
皖山潛鳳
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9樓2010-08-13 14:33:01
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