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[交流]
【求助/交流】如何高度純化蛋白，急急急 已有7人參與
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| 我是用strep-tag，純化蛋白后跑sds-page，總是有很多扎帶，如何能高度純化蛋白呢，就只得到目的條帶 |
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月月大可
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小木蟲(金幣+0.5):給個紅包，謝謝回帖交流
reasonspare(金幣+2):謝謝分享。 2010-08-12 05:59:44
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我搞蛋白晶體的，我們對蛋白的要求一般來說不低于95%�；蛘呖妓{(lán)染色咋帶較少。 根據(jù)我現(xiàn)在的經(jīng)驗來說想通過親和層析一步獲得較高純度蛋白除非掛柱后同時再使用酶切標(biāo)簽，其他情況下很難做到親和一步就獲得高純的蛋白。我們更多或采取再次使用離子交換層析，這一步可以較大的提高蛋白的純度。最后使用凝膠過濾層析看蛋白的均一性是否良好。我的經(jīng)驗是不要對凝膠過濾層析這種方法報很大希望，這一步對于蛋白純度的提高貢獻(xiàn)很小，除非是你的蛋白和雜蛋白分子量差距巨大（幾十KD）！ |
8樓2010-08-11 23:38:58
sqhnsd
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2樓2010-08-11 13:49:29
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3樓2010-08-11 13:49:49
冼亮淀粉酶
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lstt09nk(金幣+3):淀粉酶，很熱心~ 2010-08-11 18:03:37
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lstt09nk(金幣+3):淀粉酶，很熱心~ 2010-08-11 18:03:37
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有標(biāo)簽，親和層析還有很多雜帶就少見了。建議考慮下?lián)Q標(biāo)簽，例如his-tag。 不建議像2樓說的用SDS-PAGE來做蛋白質(zhì)回收，用SDS FREE的，不用做復(fù)性了，復(fù)性不是每個蛋白質(zhì)都容易做得出來的。如果你的蛋白質(zhì)表現(xiàn)出來的活性易于鑒別的的，可以考慮切膠洗脫。 3樓說的分子篩，如果是預(yù)裝柱，上樣量一般推薦為柱床體積的1%，這樣要獲得足夠蛋白質(zhì)就必須要極濃的蛋白質(zhì)。而且過柱時流速推薦不大于1毫升每分鐘，加上平衡和完事后洗柱保存，時間投入極大。不如先試一下離子交換，低鹽上樣高鹽洗脫的，鹽離子不高的話，很多蛋白質(zhì)都沒事，而且流速可高達(dá)5毫升每分鐘。如果高鹽也可耐受，還可以做疏水層析。 如果不行，就換標(biāo)簽his吧，省事。 |
4樓2010-08-11 14:38:52
jasco
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5樓2010-08-11 14:57:07
都沒做過 6樓2010-08-11 15:11:39
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7樓2010-08-11 16:40:25
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9樓2010-08-11 23:41:06
10樓2010-08-11 23:52:30
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