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virus501新蟲 (初入文壇)
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[交流]
【求助/交流】實(shí)驗(yàn)啊，老做不出來(lái)(HEV（正鏈RNA病毒）的全基因組克隆) 已有2人參與
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小弟一直在做HEV（正鏈RNA病毒，糞口傳播）的全基因組克隆�？墒且恢睕](méi)結(jié)果。現(xiàn)在把我的條件拿出來(lái)，請(qǐng)各位高手幫我分析一下原因吧，郁悶死了！ 一：RNA的提取 用OMEGA試劑盒提取豬糞中的RNA。（豬糞用PBS溶解）。 二：RT 反轉(zhuǎn)錄用的是MBI試劑盒。RNA定量為1ug。反轉(zhuǎn)錄引物用過(guò)特異性引物和oligo（dT）�；蛘邇烧呋旌稀� 三：PCR PCR所用引物特異性很好（軟件比對(duì)結(jié)果顯示），cDNA加2ul。 四：目的片段 一個(gè)長(zhǎng)1.2k。一個(gè)約6.35k。1.2k的用的是TAKARA的普通Taq酶。6.35k的用的是TAKARA的LA Taq酶。 結(jié)果： 可以說(shuō)一直沒(méi)有結(jié)果。1.2kP出的條帶都小于500bp，要不就什么都沒(méi)有。6.35k的結(jié)果也一樣，要不什么都沒(méi)有，要不在9.6k處有一條不清晰的帶（不可能，因?yàn)镠EV基因組全長(zhǎng)才7.2k）。 說(shuō)明：RNA肯定是提出來(lái)了，因?yàn)樽鲫?yáng)性篩選的時(shí)候擴(kuò)增的436bp的條帶每次重復(fù)都會(huì)出現(xiàn)，即陽(yáng)性對(duì)照沒(méi)問(wèn)題（擴(kuò)增片段靠近基因組3’端）；RT應(yīng)該沒(méi)問(wèn)題，因?yàn)樵噭┖兄械年?yáng)性對(duì)照擴(kuò)增也沒(méi)問(wèn)題。 小弟真的很郁悶，一個(gè)簡(jiǎn)單的RT-PCR都做不好，也難怪2個(gè)老板都十分惱怒。請(qǐng)各位高手幫我分析分析原因吧，謝謝了！ |
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銀蟲 (小有名氣)
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2樓2010-09-30 19:37:43
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小木蟲(金幣+0.5):給個(gè)紅包，謝謝回帖交流
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3樓2010-09-30 19:39:23
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