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【求助/交流】實驗啊，老做不出來(HEV（正鏈RNA病毒）的全基因組克隆) 已有2人參與
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小弟一直在做HEV（正鏈RNA病毒，糞口傳播）的全基因組克隆�？墒且恢睕]結果。現(xiàn)在把我的條件拿出來，請各位高手幫我分析一下原因吧，郁悶死了！ 一：RNA的提取 用OMEGA試劑盒提取豬糞中的RNA。（豬糞用PBS溶解）。 二：RT 反轉錄用的是MBI試劑盒。RNA定量為1ug。反轉錄引物用過特異性引物和oligo（dT）�；蛘邇烧呋旌稀� 三：PCR PCR所用引物特異性很好（軟件比對結果顯示），cDNA加2ul。 四：目的片段 一個長1.2k。一個約6.35k。1.2k的用的是TAKARA的普通Taq酶。6.35k的用的是TAKARA的LA Taq酶。 結果： 可以說一直沒有結果。1.2kP出的條帶都小于500bp，要不就什么都沒有。6.35k的結果也一樣，要不什么都沒有，要不在9.6k處有一條不清晰的帶（不可能，因為HEV基因組全長才7.2k）。 說明：RNA肯定是提出來了，因為做陽性篩選的時候擴增的436bp的條帶每次重復都會出現(xiàn)，即陽性對照沒問題（擴增片段靠近基因組3’端）；RT應該沒問題，因為試劑盒中的陽性對照擴增也沒問題。 小弟真的很郁悶，一個簡單的RT-PCR都做不好，也難怪2個老板都十分惱怒。請各位高手幫我分析分析原因吧，謝謝了！ |
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zhandeguo1
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- 專業(yè): 生物化學
2樓2010-09-30 19:37:43
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小木蟲(金幣+0.5):給個紅包，謝謝回帖交流
小木蟲(金幣+0.5):給個紅包，謝謝回帖交流
 本帖僅樓主可見 |
3樓2010-09-30 19:39:23
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