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[交流]
【求助/交流】AFLP選擴(kuò)產(chǎn)物彌散，請(qǐng)做過(guò)AFLP的同行們耽誤幾分鐘幫忙看看 已有4人參與
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目前在做AFLP實(shí)驗(yàn)，就在選擴(kuò)產(chǎn)物電泳時(shí)樣品全部彌散，看了很多論壇包括小木蟲(chóng)，好像大多數(shù)人都是反映這個(gè)問(wèn)題，難道就是AFLP里的哥德巴赫猜想？請(qǐng)做過(guò)這類(lèi)實(shí)驗(yàn)并且成功的同行給仍然在黑暗里摸索的我們一點(diǎn)提示和建議，或許能讓我們少走很多彎路，在此謝謝了！ 標(biāo)準(zhǔn)菌株與樣品DNA同時(shí)酶切、連接、稀釋50倍后，25微升選擇性擴(kuò)增（沒(méi)有預(yù)擴(kuò)），之后60V，3個(gè)小時(shí)瓊脂糖電泳，EB染色后，標(biāo)準(zhǔn)菌株條帶清晰，但是樣品的基本都是彌散條帶，請(qǐng)教做過(guò)AFLP實(shí)驗(yàn)的達(dá)人們，發(fā)生這樣情況的主要原因是什么？圖1是樣品的，圖2是標(biāo)準(zhǔn)菌株的。 PS：之后把樣品的連接產(chǎn)物稀釋50，100和200倍，同時(shí)將mastermix（天根，2*）分12.5，10，6微升，再次做選擇性擴(kuò)增，仍然全部彌散。今天選擇2個(gè)樣品分別做以下操作： 1，退火溫度提高5度，循環(huán)次數(shù)不變 2，循環(huán)次數(shù)減少到20個(gè)，退火溫度不變 3，重新酶切、連接、稀釋100倍，PCR 4，原來(lái)連接產(chǎn)物用醋酸銨、無(wú)水乙醇、70%乙醇純化后，稀釋100倍，PCR。 結(jié)果一句話：彌散。 后來(lái)純化后稀釋100，200，500，1000倍后，仍然是彌散，不過(guò)有1-2條的條帶。 DNA加10倍loading buffer電泳有條帶，酶切連接產(chǎn)物電泳有條帶，不過(guò)比標(biāo)準(zhǔn)菌株的要暗。（當(dāng)然，由于本人第一次做這類(lèi)實(shí)驗(yàn)，到底酶切是否切開(kāi)，盡管有電泳圖，還不是非常的懂），圖3為酶切連接電泳圖 認(rèn)為是DNA量少，加1，2，5微升直接PCR，仍然彌散 之后將mastermix改為15，20，22微升，還是彌散，滿(mǎn)世界的彌散彌散彌散………… 所以就搞不明白了，同樣一起反應(yīng)的酶切，連接，PCR體系，前面十幾個(gè)標(biāo)準(zhǔn)菌株全部有條帶，到了樣品立即就沒(méi)有了，很是奇怪。 圖1 標(biāo)準(zhǔn)菌株AFLP電泳圖，不用解釋了，2個(gè)樣品間都是marker 圖2 樣品AFLP電泳圖，也……不用解釋了，彌散的都是樣品 圖3 酶切連接圖，maker左邊的是酶切，最亮的是標(biāo)準(zhǔn)菌株的；marker右邊的是連接，最亮的也是標(biāo)準(zhǔn)菌株的，是同一菌株用新舊試劑，結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)菌株仍然有很好的條帶，而樣品沒(méi)有    [ Last edited by lstt09nk on 2010-10-19 at 11:12 ] |
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