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[交流]
【求助/交流】AFLP選擴產(chǎn)物彌散，請做過AFLP的同行們耽誤幾分鐘幫忙看看 已有4人參與
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目前在做AFLP實驗，就在選擴產(chǎn)物電泳時樣品全部彌散，看了很多論壇包括小木蟲，好像大多數(shù)人都是反映這個問題，難道就是AFLP里的哥德巴赫猜想？請做過這類實驗并且成功的同行給仍然在黑暗里摸索的我們一點提示和建議，或許能讓我們少走很多彎路，在此謝謝了！ 標準菌株與樣品DNA同時酶切、連接、稀釋50倍后，25微升選擇性擴增（沒有預擴），之后60V，3個小時瓊脂糖電泳，EB染色后，標準菌株條帶清晰，但是樣品的基本都是彌散條帶，請教做過AFLP實驗的達人們，發(fā)生這樣情況的主要原因是什么？圖1是樣品的，圖2是標準菌株的。 PS：之后把樣品的連接產(chǎn)物稀釋50，100和200倍，同時將mastermix（天根，2*）分12.5，10，6微升，再次做選擇性擴增，仍然全部彌散。今天選擇2個樣品分別做以下操作： 1，退火溫度提高5度，循環(huán)次數(shù)不變 2，循環(huán)次數(shù)減少到20個，退火溫度不變 3，重新酶切、連接、稀釋100倍，PCR 4，原來連接產(chǎn)物用醋酸銨、無水乙醇、70%乙醇純化后，稀釋100倍，PCR。 結(jié)果一句話：彌散。 后來純化后稀釋100，200，500，1000倍后，仍然是彌散，不過有1-2條的條帶。 DNA加10倍loading buffer電泳有條帶，酶切連接產(chǎn)物電泳有條帶，不過比標準菌株的要暗。（當然，由于本人第一次做這類實驗，到底酶切是否切開，盡管有電泳圖，還不是非常的懂），圖3為酶切連接電泳圖 認為是DNA量少，加1，2，5微升直接PCR，仍然彌散 之后將mastermix改為15，20，22微升，還是彌散，滿世界的彌散彌散彌散………… 所以就搞不明白了，同樣一起反應的酶切，連接，PCR體系，前面十幾個標準菌株全部有條帶，到了樣品立即就沒有了，很是奇怪。 圖1 標準菌株AFLP電泳圖，不用解釋了，2個樣品間都是marker 圖2 樣品AFLP電泳圖，也……不用解釋了，彌散的都是樣品 圖3 酶切連接圖，maker左邊的是酶切，最亮的是標準菌株的；marker右邊的是連接，最亮的也是標準菌株的，是同一菌株用新舊試劑，結(jié)果標準菌株仍然有很好的條帶，而樣品沒有    [ Last edited by lstt09nk on 2010-10-19 at 11:12 ] |
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