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【轉帖】培養(yǎng)細胞的污染及排除 已有5人參與
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細胞培養(yǎng)的污染問題十分重要，一旦發(fā)生污染，將導致前功盡棄。所以細胞培養(yǎng)一定要建立無菌觀念。遇到培養(yǎng)污染要分析原因，及時處理。 凡混入細胞培養(yǎng)環(huán)境中對細胞生存有害的成分和造成細胞不純的異物都應視為污染 細胞污染不能完全被消除，但能減少其發(fā)生的頻率和后果的嚴重性 細胞污染的分類 物理污染 化學污染 生物污染（支原體污染） 控制污染 掌握良好的無菌操作技術 建立細胞庫 合理應用抗生素 保持工作區(qū)清潔 建立良好的規(guī)章制度 檢測細胞污染 一、污染途徑 空氣：每立方米含菌數(shù)不應超過1－5個 器材： 操作： 血清： 組織樣本： 二、對細胞的影響 生長緩慢，分裂相減少，細胞變粗糙，輪廓增強，胞漿多顆粒狀物。重者細胞增殖停止，分裂相消失，胞質中出現(xiàn)大量堆積物，細胞變圓或崩解，從瓶壁脫落。 細胞污染的種類和判定 細胞培養(yǎng)中常見的污染物有細菌、酵母菌、真菌、支原體和病毒等。在出現(xiàn)以下情況時培養(yǎng)的細胞可能有污染： 培養(yǎng)液的酸堿度發(fā)生異常的改變。 培養(yǎng)液出現(xiàn)混濁。 光鏡觀察到菌絲和顆粒。 細胞出現(xiàn)死亡或增殖緩慢等。 三、污染物的檢測 1. 真菌污染 常見真菌種類：多為煙曲霉、黑曲霉、毛霉菌、孢子霉、白念珠菌、酵母菌等 真菌污染判斷： 肉眼可見培養(yǎng)液中見白色或黃色漂浮物， 倒置鏡下見細胞間縱橫交錯，絲狀、管狀、 樹枝懸浮飄蕩的菌絲或形態(tài)呈卵形，散在細胞周邊和細胞之間生長， 培養(yǎng)液多不混濁。 2.細菌污染 常見細菌種類：大腸桿菌、白色葡萄球菌、假單孢菌等 細菌污染判斷： 培養(yǎng)液顏色變黃，出現(xiàn)混濁 鏡下觀察，大量圓球狀顆立漂浮，細胞表面和周圍有大量細菌 細胞生長停止，并有中毒表現(xiàn) 細菌和真菌污染的檢測： 涂片染色鏡檢； 接種培養(yǎng)：Trypticase大豆肉湯、BHI、Thioglycocollate肉湯和血瓊脂板適于廣泛的細菌檢測；Sabouraud肉湯、YM肉湯和營養(yǎng)肉湯適于檢測真菌。 檢測到陽性結果后，應高壓滅菌處理污染的培養(yǎng)物及其用具 3.支原體: 常見而棘手。 支原體污染細胞后，能抑制細胞代謝和生長，改變核酸合成，影響細胞的抗原性，引起細胞染色體改變，干擾病毒的復制，以及具有類病毒作用。在培養(yǎng)細胞初期，由于支原體對細胞的繁殖影響較小而往往被忽略。 支原體檢測方法和處理： 熒光技術檢測：支原體含有DNA，能與熒光染料Hoechest33258特異性的結合，可根據(jù)細胞表面的熒光來顯示細胞是否污染有支原體。 相差顯微鏡：相差油鏡下呈暗色微小顆粒。 電鏡觀察：SEM，TEM。 DNA分子雜交：檢出率高但復雜。 檢測完畢后，所有實驗用具均應經過高壓消毒處理。 污染支原體后的處理： 抗生素處理：如加入泰樂菌素等。 共培養(yǎng)法：與巨噬細胞共培養(yǎng)。 重新克隆法：抗生素處理后，將細胞稀釋后傳代，每周換2次含抗生素的新鮮培養(yǎng)液，4-5周后，重復克隆2次。 過濾法：0.22µm孔徑濾膜正壓過濾。 4.污染病毒的檢測 致細胞病變效應（CPE）或集落的檢測：采用相差顯微鏡檢測 血細胞吸附試驗； 四、細胞間交叉污染 為避免細胞間交叉污染，應注意： 了解各細胞系的特征； 培養(yǎng)各細胞系的操作手續(xù)要快速； 培養(yǎng)各細胞系不用同一瓶的培養(yǎng)液和酶等； 吸過培養(yǎng)液和細胞懸液的吸管，不能放回儲存培養(yǎng)液和酶的瓶內； 經常檢查培養(yǎng)物特征，注意任何突然的形態(tài)學改變，通過染色體或同工酶譜分析，檢查是否有交叉污染。 五、微生物污染的防治 抗生素:聯(lián)合應用,常用量的5－10倍,用藥24－48小時,對早期污染有效. 加溫處理:針對支原體污染, 41度5－10小時,最長不超過18小時. 動物體內接種:將受到污染的細胞接種在同種動物皮下或腹腔,借動物體內的免疫系統(tǒng)消滅微生物. 資料來源：www.yiqi120.com/zlzx.asp |
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2樓2010-10-19 11:44:41
3樓2014-04-24 13:08:56
4樓2015-06-21 10:53:14
5樓2016-01-29 06:45:12
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6樓2016-03-10 12:00:28
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