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global.wun銀蟲 (正式寫手)
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[交流]
【轉(zhuǎn)帖】培養(yǎng)細(xì)胞的污染及排除 已有5人參與
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細(xì)胞培養(yǎng)的污染問題十分重要，一旦發(fā)生污染，將導(dǎo)致前功盡棄。所以細(xì)胞培養(yǎng)一定要建立無菌觀念。遇到培養(yǎng)污染要分析原因，及時(shí)處理。 凡混入細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境中對(duì)細(xì)胞生存有害的成分和造成細(xì)胞不純的異物都應(yīng)視為污染 細(xì)胞污染不能完全被消除，但能減少其發(fā)生的頻率和后果的嚴(yán)重性 細(xì)胞污染的分類 物理污染 化學(xué)污染 生物污染（支原體污染） 控制污染 掌握良好的無菌操作技術(shù) 建立細(xì)胞庫(kù) 合理應(yīng)用抗生素 保持工作區(qū)清潔 建立良好的規(guī)章制度 檢測(cè)細(xì)胞污染 一、污染途徑 空氣：每立方米含菌數(shù)不應(yīng)超過1－5個(gè) 器材： 操作： 血清： 組織樣本： 二、對(duì)細(xì)胞的影響 生長(zhǎng)緩慢，分裂相減少，細(xì)胞變粗糙，輪廓增強(qiáng)，胞漿多顆粒狀物。重者細(xì)胞增殖停止，分裂相消失，胞質(zhì)中出現(xiàn)大量堆積物，細(xì)胞變圓或崩解，從瓶壁脫落。 細(xì)胞污染的種類和判定 細(xì)胞培養(yǎng)中常見的污染物有細(xì)菌、酵母菌、真菌、支原體和病毒等。在出現(xiàn)以下情況時(shí)培養(yǎng)的細(xì)胞可能有污染： 培養(yǎng)液的酸堿度發(fā)生異常的改變。 培養(yǎng)液出現(xiàn)混濁。 光鏡觀察到菌絲和顆粒。 細(xì)胞出現(xiàn)死亡或增殖緩慢等。 三、污染物的檢測(cè) 1. 真菌污染 常見真菌種類：多為煙曲霉、黑曲霉、毛霉菌、孢子霉、白念珠菌、酵母菌等 真菌污染判斷： 肉眼可見培養(yǎng)液中見白色或黃色漂浮物， 倒置鏡下見細(xì)胞間縱橫交錯(cuò)，絲狀、管狀、 樹枝懸浮飄蕩的菌絲或形態(tài)呈卵形，散在細(xì)胞周邊和細(xì)胞之間生長(zhǎng)， 培養(yǎng)液多不混濁。 2.細(xì)菌污染 常見細(xì)菌種類：大腸桿菌、白色葡萄球菌、假單孢菌等 細(xì)菌污染判斷： 培養(yǎng)液顏色變黃，出現(xiàn)混濁 鏡下觀察，大量圓球狀顆立漂浮，細(xì)胞表面和周圍有大量細(xì)菌 細(xì)胞生長(zhǎng)停止，并有中毒表現(xiàn) 細(xì)菌和真菌污染的檢測(cè)： 涂片染色鏡檢； 接種培養(yǎng)：Trypticase大豆肉湯、BHI、Thioglycocollate肉湯和血瓊脂板適于廣泛的細(xì)菌檢測(cè)；Sabouraud肉湯、YM肉湯和營(yíng)養(yǎng)肉湯適于檢測(cè)真菌。 檢測(cè)到陽(yáng)性結(jié)果后，應(yīng)高壓滅菌處理污染的培養(yǎng)物及其用具 3.支原體: 常見而棘手。 支原體污染細(xì)胞后，能抑制細(xì)胞代謝和生長(zhǎng)，改變核酸合成，影響細(xì)胞的抗原性，引起細(xì)胞染色體改變，干擾病毒的復(fù)制，以及具有類病毒作用。在培養(yǎng)細(xì)胞初期，由于支原體對(duì)細(xì)胞的繁殖影響較小而往往被忽略。 支原體檢測(cè)方法和處理： 熒光技術(shù)檢測(cè)：支原體含有DNA，能與熒光染料Hoechest33258特異性的結(jié)合，可根據(jù)細(xì)胞表面的熒光來顯示細(xì)胞是否污染有支原體。 相差顯微鏡：相差油鏡下呈暗色微小顆粒。 電鏡觀察：SEM，TEM。 DNA分子雜交：檢出率高但復(fù)雜。 檢測(cè)完畢后，所有實(shí)驗(yàn)用具均應(yīng)經(jīng)過高壓消毒處理。 污染支原體后的處理： 抗生素處理：如加入泰樂菌素等。 共培養(yǎng)法：與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)。 重新克隆法：抗生素處理后，將細(xì)胞稀釋后傳代，每周換2次含抗生素的新鮮培養(yǎng)液，4-5周后，重復(fù)克隆2次。 過濾法：0.22µm孔徑濾膜正壓過濾。 4.污染病毒的檢測(cè) 致細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE）或集落的檢測(cè)：采用相差顯微鏡檢測(cè) 血細(xì)胞吸附試驗(yàn)； 四、細(xì)胞間交叉污染 為避免細(xì)胞間交叉污染，應(yīng)注意： 了解各細(xì)胞系的特征； 培養(yǎng)各細(xì)胞系的操作手續(xù)要快速； 培養(yǎng)各細(xì)胞系不用同一瓶的培養(yǎng)液和酶等； 吸過培養(yǎng)液和細(xì)胞懸液的吸管，不能放回儲(chǔ)存培養(yǎng)液和酶的瓶?jī)?nèi)； 經(jīng)常檢查培養(yǎng)物特征，注意任何突然的形態(tài)學(xué)改變，通過染色體或同工酶譜分析，檢查是否有交叉污染。 五、微生物污染的防治 抗生素:聯(lián)合應(yīng)用,常用量的5－10倍,用藥24－48小時(shí),對(duì)早期污染有效. 加溫處理:針對(duì)支原體污染, 41度5－10小時(shí),最長(zhǎng)不超過18小時(shí). 動(dòng)物體內(nèi)接種:將受到污染的細(xì)胞接種在同種動(dòng)物皮下或腹腔,借動(dòng)物體內(nèi)的免疫系統(tǒng)消滅微生物. 資料來源：www.yiqi120.com/zlzx.asp |
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5樓2016-01-29 06:45:12
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小木蟲: 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖
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6樓2016-03-10 12:00:28
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