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[交流]
【求助/交流】引物及PCR產(chǎn)物連入載體的問題求助�。�！
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今天看文獻(xiàn)遇到點問題不太明白，請教大家： 1，設(shè)計一對引物擴(kuò)增某基因，引物如下：, 5‘-GCGGCGGAATTCATGGCTAG TATCAAACAAATAG-30’ containing the ATG start codon, introduced an EcoRI restriction site (underlined), and the carboxyl terminal primer 50-GCGGCG TCTAGATCACTTGA CCCTGAGTCTTC-30, including the stop codon, introduced an XbaI restriction site. 問題：起始密碼子和終止密碼子前面均引入酶切位點序列，但是酶切位點序列前面的一段序列是用來做什么用的？（GCGGCG）。此外，引物的退火溫度計算的時候是按照序列全長計算？or按照酶切位點后的序列計算？ 2。加入酶切位點后的引物擴(kuò)增出來序列是否粘性末端？能否直接連入T-載體？本文實驗方法中說擴(kuò)增結(jié)果純化后直接連入pGME-T載體，然后轉(zhuǎn)到E.coli DH5a中去測序。T載體不是末端為一個T堿基的粘性末端嗎，PCR結(jié)果必須是多一個A堿基的粘性末端才能連接上（本人理解）按照我這樣的理解，解釋不了文中直接將產(chǎn)物連接到載體中，望高人解疑！��！ |
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feiye2214
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amisking(金幣+3):good！ 2010-10-24 19:12:50
hnndpt(金幣+1):非常感謝！ 2010-10-24 19:59:58
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據(jù)我所知，對你問題的解答如下： 1.你提到的酶切位點前面的序列是保護(hù)堿基，一般3-4個，你這個有點多，但性質(zhì)是保護(hù)堿基，保護(hù)酶切位點，因為在末端容易降解、丟失 2.PCR之后的序列就可以連上T載體啊，怎么可能是粘性末端呢？3‘端有A重復(fù)是taq酶的特性，所以才有TA克隆這項技術(shù)。你TA克隆后再去酶切，因為你在引物里已經(jīng)設(shè)計了酶切位點，（個人覺得，設(shè)計的酶切位點應(yīng)該不能和T載體上的酶切位點重復(fù)），酶切后才有粘性末端，再和同樣酶酶切的載體質(zhì)粒（酶切后是線性的）連接，重組質(zhì)粒再轉(zhuǎn)化大腸。就好了 希望有所幫助 |
2樓2010-10-24 18:42:27
feiye2214
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3樓2010-10-24 18:44:04
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