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[交流]
【求助/交流】引物及PCR產(chǎn)物連入載體的問題求助�。�！
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今天看文獻(xiàn)遇到點(diǎn)問題不太明白，請(qǐng)教大家： 1，設(shè)計(jì)一對(duì)引物擴(kuò)增某基因，引物如下：, 5‘-GCGGCGGAATTCATGGCTAG TATCAAACAAATAG-30’ containing the ATG start codon, introduced an EcoRI restriction site (underlined), and the carboxyl terminal primer 50-GCGGCG TCTAGATCACTTGA CCCTGAGTCTTC-30, including the stop codon, introduced an XbaI restriction site. 問題：起始密碼子和終止密碼子前面均引入酶切位點(diǎn)序列，但是酶切位點(diǎn)序列前面的一段序列是用來做什么用的？（GCGGCG）。此外，引物的退火溫度計(jì)算的時(shí)候是按照序列全長(zhǎng)計(jì)算？or按照酶切位點(diǎn)后的序列計(jì)算？ 2。加入酶切位點(diǎn)后的引物擴(kuò)增出來序列是否粘性末端？能否直接連入T-載體？本文實(shí)驗(yàn)方法中說擴(kuò)增結(jié)果純化后直接連入pGME-T載體，然后轉(zhuǎn)到E.coli DH5a中去測(cè)序。T載體不是末端為一個(gè)T堿基的粘性末端嗎，PCR結(jié)果必須是多一個(gè)A堿基的粘性末端才能連接上（本人理解）按照我這樣的理解，解釋不了文中直接將產(chǎn)物連接到載體中，望高人解疑�。�！ |
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feiye2214
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★ ★ ★
amisking(金幣+3):good！ 2010-10-24 19:12:50
hnndpt(金幣+1):非常感謝！ 2010-10-24 19:59:58
amisking(金幣+3):good！ 2010-10-24 19:12:50
hnndpt(金幣+1):非常感謝！ 2010-10-24 19:59:58
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據(jù)我所知，對(duì)你問題的解答如下： 1.你提到的酶切位點(diǎn)前面的序列是保護(hù)堿基，一般3-4個(gè)，你這個(gè)有點(diǎn)多，但性質(zhì)是保護(hù)堿基，保護(hù)酶切位點(diǎn)，因?yàn)樵谀┒巳菀捉到�、丟失 2.PCR之后的序列就可以連上T載體啊，怎么可能是粘性末端呢？3‘端有A重復(fù)是taq酶的特性，所以才有TA克隆這項(xiàng)技術(shù)。你TA克隆后再去酶切，因?yàn)槟阍谝锢镆呀?jīng)設(shè)計(jì)了酶切位點(diǎn)，（個(gè)人覺得，設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)應(yīng)該不能和T載體上的酶切位點(diǎn)重復(fù)），酶切后才有粘性末端，再和同樣酶酶切的載體質(zhì)粒（酶切后是線性的）連接，重組質(zhì)粒再轉(zhuǎn)化大腸。就好了 希望有所幫助 |
2樓2010-10-24 18:42:27
feiye2214
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3樓2010-10-24 18:44:04
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