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[交流] 【求助/交流】PCR的若干問(wèn)題已有7人參與

PCR的退火溫度怎么決定�。吭谥酪粚�(duì)引物的各自TM值的情況下，怎么確定退火溫度？
擴(kuò)增1665bp和1445bp的條帶，有沒(méi)什么特殊的要求？
兩對(duì)引物一起做，一個(gè)引物各做8個(gè)溫度梯度，為什么一個(gè)引物都擴(kuò)出來(lái)了，一個(gè)引物都沒(méi)有擴(kuò)出來(lái)？

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1樓 2010-10-30 14:09:04

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超然渡陳之家

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“為什么一個(gè)引物都擴(kuò)出來(lái)了，一個(gè)引物都沒(méi)有擴(kuò)出來(lái)”這句話什么意思？

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2樓2010-10-30 15:29:11

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aaron2012

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dhd997(金幣+1):鼓勵(lì)交流。 2010-11-01 10:14:03

延伸時(shí)間你是多少啊然后你設(shè)置的溫度梯度是多少啊一般是給的TM值減去5到10，我建議你試一下55度我也遇到和你一樣的情況 55 就做出來(lái)了另外你看是不是加樣的時(shí)候出現(xiàn)問(wèn)題了多做幾次

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生物，特別是分子生物，貴在堅(jiān)持！

3樓2010-11-01 09:50:32

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yixuanwin

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dhd997(金幣+1):謝謝交流。 2010-11-01 10:14:10

那么短的片段。怎么都能擴(kuò)出來(lái)的。擴(kuò)不出來(lái)考慮其他因素比如引物設(shè)計(jì) 比如樣品。
這樣的東西最好重復(fù)幾次。別一次沒(méi)出來(lái)就問(wèn)。很多偶然因素你并不知道的。

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4樓2010-11-01 09:55:24

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amilie030312

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dhd997(金幣+1):謝謝交流。 2010-11-01 10:14:18

出和不出影響因素很多，要看退火溫度對(duì)不對(duì)，一般的退火溫度是TM值減5左右，如果做梯度都沒(méi)做出來(lái)首先可能是你溫度范圍選擇的不對(duì)，其次是否是完全按照說(shuō)明書(shū)去做的，再有模板是否GC含量很高，這些都有影響。
呵呵，最后也可能所有問(wèn)題都想到了還不出，那就換引物吧，片段1K多不算長(zhǎng)

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5樓2010-11-01 09:56:25

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xj871008

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退火溫度越低，條帶越多。引物上應(yīng)該都寫(xiě)退火溫度吧，根據(jù)引物上寫(xiě)的退火溫度再低四五度，應(yīng)該可以吧。我畢設(shè)就是這么做的。

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6樓2010-11-01 10:02:23

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愛(ài)莫若月

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退火溫度應(yīng)該是按照引物上的TM值吧，兩個(gè)不一樣的時(shí)候就按低的那個(gè)

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7樓2010-11-01 10:52:04

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hjyxm

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正在學(xué)習(xí)這方面的，希望有更多人來(lái)解決這些問(wèn)題啊！

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好好工作！

8樓2010-11-03 15:34:50

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