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小木蟲論壇-學術科研互動平臺 » 生物醫(yī)藥區(qū) » 分子生物 » 綜合其他 » 【求助/交流】關于引物
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[交流]
【求助/交流】關于引物
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現(xiàn)在，我有了載體，有了目的基因的片段。我的目的是為了把這段基因連到載體上讓其表達。我想知道的是，我是否應該先大量制備這種載體和目的基因片段？ 如果是，那么，載體是要通過大量搖瓶培養(yǎng)導入載體的菌體然后裂解獲得是嗎？ 目的基因片段（外公司合成）是要經(jīng)過PCR大量合成對吧？ 問題來了，這段基因片段引物問題，我已經(jīng)有了酶切位點。這段引物上有多少要與目的基因片段重合？3‘端是不是要留有一部分不與目的片段重合？這段不重合的大約要多少BP？ 當我把重組子做好之后如何檢驗是否連接成功？ 沒有誘導檢測位點，IPTG什么的肯定不能用。用PCR應該也可以把？ 問題又來了，這時的PCR所用引物可以是前面擴增基因片段的引物嗎？ 如果可以，那么再返回前面設計引物的階段，我這個引物要與載體上片段重合多少BP？ 要有游離端嗎？ 糾結了一晚上，依然百思不得其解，求高人指點迷津~~~~ |
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小木蟲(金幣+0.5):給個紅包，謝謝回帖交流
魑魅-魍魎(金幣+10):太感謝了，終于遇到一個懂這個方面的人了，非常感謝 2010-11-12 08:39:19
lstt09nk(金幣+2):不錯，歡迎常來生物版 2010-11-12 09:20:37
小木蟲(金幣+0.5):給個紅包，謝謝回帖交流
魑魅-魍魎(金幣+10):太感謝了，終于遇到一個懂這個方面的人了，非常感謝 2010-11-12 08:39:19
lstt09nk(金幣+2):不錯，歡迎常來生物版 2010-11-12 09:20:37
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我一般至少選取18個重合堿基（3’端要重合），前面從5‘端到重合位點可以加酶切位點等，據(jù)我們實驗室某位博士說前面加100bp都可以PCR出來，所以不用擔心。 TM值僅供參考，我一般手算，A或T算2，G或C算4，只算重合區(qū)域。 實驗初期建立信心很重要，等做習慣了，PCR應該不會是困擾你的問題。 我的郵箱：zhangxn2010@yahoo.cn,歡迎探討，祝實驗順利. |
15樓2010-11-11 23:57:14
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