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beisimai895木蟲 (小有名氣)
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[交流]
【求助/交流】非大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備 已有2人參與
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| 請教一下，非大腸桿菌的感受態(tài)細(xì)胞如何制備，比如說假單胞菌或芽孢桿菌，之后打算做電轉(zhuǎn)，需要詳細(xì)的方法，各位有好的方法的，給我。 |
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wjswj
木蟲 (正式寫手)
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記得當(dāng)年做BT的感受態(tài)細(xì)胞就是離心，然后洗啊洗的，洗幾遍之后用了個(gè)黏糊糊的溶液給懸起來就ok了。 以下內(nèi)容源自互聯(lián)網(wǎng)，請參考。 試劑準(zhǔn)備 1000ml三角瓶 *2 每瓶裝500ml 液體LB，115度滅菌15min。 50ml離心管2個(gè)。 10%甘油超純水配制 1L 滅菌300ul ep管50個(gè)。滅菌槍頭：100ul，1000ul 大腸桿菌電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞制備 第一天： 1. 將適合菌株（如XL1-Blue, DH5α）置于LB或其他營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基上，在37°C下過夜培養(yǎng) 2. 高溫滅菌大的離心瓶（1000ml）兩個(gè)以備第二天搖瓶用 3. 1L10%滅菌甘油，保存于冷凍室中以備第二天重懸浮細(xì)胞用 第二天： 4. 轉(zhuǎn)移0.2-1ml過夜培養(yǎng)物至裝有500ml LB（或其他營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基）的1升三角瓶中，接種兩瓶。 5. 37°C下劇烈振蕩培養(yǎng)2-3小時(shí) 6. 定時(shí)監(jiān)控O.D.600值（培養(yǎng)1小時(shí)后每半小時(shí)測定一次） 7. 當(dāng)O.D.600值達(dá)到0.5左右時(shí)，從搖床中取出搖瓶，置于冰上冷卻至少15分鐘（需要的話這種方式可以存放培養(yǎng)液數(shù)小時(shí)） 8. 細(xì)胞在4°C 2500g下離心5分鐘，棄上清液（如需要，沉淀可在4°C的10%甘油中保存一兩天） 9. 用少量的（約3-5ml）滅菌的冰冷10%甘油重懸浮細(xì)胞。然后冰冷10%甘油稀釋至離心管的2/3體積。 10. 照上面步驟重復(fù)離心，小心棄去上清液 11. 照上面步驟用滅菌的冰冷10%甘油重懸浮細(xì)胞 12. 離心，棄上清液 13. 用20ml滅菌的、冰冷后的10%甘油重懸浮細(xì)胞 14. 照上面步驟離心，小心棄去上清液（沉淀可能會很松散） 15. 用10%甘油重懸浮細(xì)胞至最終體積為2-3ml ，保證細(xì)胞的最終濃度為:稀釋100倍后OD600=1. 16. 將細(xì)胞按50μl等份裝入微量離心管，于-80°C保存 轉(zhuǎn)化方法: 1. 在冰上解凍電感受態(tài)細(xì)胞添加1-3μl DNA，質(zhì)粒1ul，連接產(chǎn)物2-3ul ，冰上培育約5分鐘 3. 轉(zhuǎn)移DNA/細(xì)胞混合物至冷卻后的2mm電穿孔容器（無泡）中 4. 加載P1000，準(zhǔn)備好300μl LB 或 2xYT 5. 對電穿孔容器進(jìn)行脈沖（200 歐姆, 25μFd, 2.5 千伏）（檢查時(shí)間常數(shù)，應(yīng)該在3以上） 6. 立即添加300μl 的LB或2xYT至電穿孔容器中 7. 37°C下培養(yǎng)細(xì)胞30分鐘至45min以復(fù)原 （如果做質(zhì)粒轉(zhuǎn)化此步驟可以省略） 8. 轉(zhuǎn)移細(xì)胞至適當(dāng)?shù)墓腆w選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng) 農(nóng)桿菌和大腸桿菌類似 |
2樓2010-11-18 14:05:26
日光海
銅蟲 (小有名氣)
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- 專業(yè): 水產(chǎn)生物免疫學(xué)與病害控制
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小木蟲: 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖
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| 《Scarless and sequential gene modification in Pseudomonas using PCR product flanked by short homology regions》你看看這個(gè)文獻(xiàn)，銅綠假單胞菌的電擊轉(zhuǎn)化。不過我按照這個(gè)文獻(xiàn)的方法做另一個(gè)假單胞菌，沒做出來，可能不同的假單胞菌電擊條件不一樣，感受態(tài)制備主要是用去離子水和甘油洗干凈，加入的外援DNA最好濕用去離子水溶解的，不要用試劑盒中的buffer溶�！�3 種假單胞菌CaCl2法感受態(tài)細(xì)胞制備及轉(zhuǎn)化條件》這個(gè)文獻(xiàn)是熱激轉(zhuǎn)化感受態(tài)制備的，我試過了，可以將外源質(zhì)粒導(dǎo)入進(jìn)我分離的一個(gè)野生假單胞菌。不過效率比較低，復(fù)蘇后將1ml菌液離心濃縮成100μL全部涂板，才長出三個(gè)菌落，但都是陽性。個(gè)人覺得還是電擊轉(zhuǎn)化效率高，而且電擊感受態(tài)制備很簡單。 |
3樓2015-06-26 15:54:14
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