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wangdandelia木蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
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[交流]
【求助/交流】DNA片段連接的溫度和反應(yīng)條件 已有5人參與
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DNA連接反應(yīng)的溫度和條件各是多少啊？上網(wǎng)也沒(méi)查到相關(guān)的具體說(shuō)明，比如說(shuō)： 1. 粘末端之間的連接體系和反應(yīng)條件； 2， 平末端之間的連接體系和反應(yīng)條件； 3，載體與大片段之間的連接體系和反應(yīng)條件； 4， 載體與小片段之間的連接體系和反應(yīng)條件。 聽(tīng)說(shuō)是4攝氏度適用于任何片段的連接，可是我覺(jué)得4攝氏度溫度太低，那樣的話分子的運(yùn)動(dòng)也緩慢，不適合連接啊。 我用的是NEB公司的 T4 DNA 連接酶。 [ Last edited by wangdandelia on 2010-11-19 at 10:46 ] |
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2樓2010-11-18 23:28:00
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T4說(shuō)明書(shū)上這樣寫(xiě)的： 為方便起見(jiàn)，連接反應(yīng)可以在室溫（20-25 ℃）條件下進(jìn)行。粘性末端連接：在 20 μl反應(yīng)體系中加入 1 μl T4 DNA 連接酶，反應(yīng) 10 分鐘。平齊末端連接：在 20 μl 反應(yīng)體系中加入 1 μl T4 DNA連接酶反應(yīng) 2 小時(shí)，或者加入 1 μl 高濃度 T4 DNA 連接酶反應(yīng) 10 分鐘。 NEB 快速連接試劑盒 [NEB #M2200S（30 次反應(yīng)），或 NEB #M2200L（150 次反應(yīng)）] 可在室溫下 5 分鐘內(nèi)完成平齊和粘性末端的連接。 NEB的酶我一般是用16度連接過(guò)夜，沒(méi)啥問(wèn)題的。 |
7樓2010-11-23 20:44:04
wangdandelia
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8樓2010-11-23 21:31:36
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